Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop
Summary
Denne protokollen beskriver teknikker som brukes til å bestemme ion kanal strukturer av cryo-elektronmikroskop, inkludert en baculovirus å effektivt uttrykke genene i pattedyrceller med minimal innsats og toksisitet, protein utvinning, rensing, og kvalitet kontroll, prøve rutenettet forberedelse og screening, samt innsamling og behandling.
Abstract
Forbigående reseptor potensielle kanaler (TRPCs) med godkjent TRP og er ikke-selektivt kasjon kanaler som spiller en viktig rolle i kalsium homeostase, spesielt store-opererte kalsium oppføring, som er avgjørende for å opprettholde riktig funksjon av synaptiske vesicle utgivelsen og intracellulær signalveier. Følgelig har TRPC kanaler vært innblandet i en rekke menneskelige sykdommer, inkludert hjerte sykdommer som hjerte-hypertrofi, nevrodegenerative lidelser som Parkinsons sykdom og nevrologiske lidelser som spinocerebellar ataksi. Derfor representerer TRPC kanaler et mulig pharmacologic mål i menneskelige sykdommer. Molekylære mekanismer av gating i disse kanalene er imidlertid uklart. Problemer å skaffe store mengder stabil, homogen og renset protein er en begrensende faktor i strukturen besluttsomhet studier, spesielt for pattedyr membran proteiner som TRPC ion kanalene. Her presenterer vi en protokoll for store uttrykk for pattedyr ion kanal membran proteiner med en modifisert baculovirus gene overføring system og rensing av disse proteinene ved affinity og størrelse-utestenging kromatografi. Videre presenterer vi en protokoll å samle single-partikkel cryo-elektron mikroskopi bilder fra renset protein og bruke disse bildene til å bestemme protein strukturen. Proteinstrukturer er en kraftfull metode for å forstå mekanismene av gating og funksjon i ionekanaler.
Introduction
Kalsium er involvert i mest cellulære prosesser inkludert signalering cascades, transkripsjon kontroll, nevrotransmitter-løslate og hormon molekyl syntese1,2,3. Homøostatisk vedlikehold av cytosolic gratis kalsium er avgjørende for helse og funksjon av celler. En av de store mekanismene intracellulær kalsium homeostasis er store-opererte kalsium oppføring (SOCE), en prosess der uttømming av kalsium lagret i endoplasmatiske retikulum (ER) utløsere åpningen av ionekanaler på plasma membranen å lette den påfyll av ER kalsium, som deretter kan brukes ved signalisering ytterligere4,5,6. Forbigående reseptor potensielle kanaler (TRPCs), som er kalsium-permeable kanaler tilhører TRP gruppe, har blitt identifisert som en sentral aktør i SOCE7,8,9 .
Blant de syv medlemmene i TRPC familien, TRPC3, TRPC6 og TRPC7 utgjør en undergruppe på homologue, og de er unike evne til å aktiveres av lipid sekundære messenger diacylglycerol (DAG), et fornedrelse produkt av signalnettverk lipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 uttrykkes svært glatt muskel og i hjerne og lillehjernen regioner i hjernen, der det spiller viktige roller i kalsium signalering som påvirker neurotransmission og neurogenesis12,13. Dysfunksjon av TRPC3 har vært knyttet til sentrale nervesystemet lidelser, kardiovaskulære lidelser og visse kreftformer som ovarian adenocarcinoma14,15,16. Derfor holder TRPC3 løftet som farmasøytiske mål for behandling av disse sykdommene. Utviklingen av målrettede narkotika opptrer på TRPC3 har vært begrenset av mangel på forståelse av sin molekylære aktivisering mekanismer, inkludert lipid bindende områder17,18. Vi har rapportert første atomic oppløsning strukturen av menneskelig TRPC3 kanalen (hTRPC3) og to lipid bindende nettsteder i lukket tilstand, å gi viktig innsikt i disse mekanismene19.
Den avgjørende faktoren for å bestemme strukturen av en membran proteinet i høy oppløsning er å skaffe protein av høy kvalitet. Tilsvarende screening av uttrykk og rensing må skaffe høykvalitets protein kan være en tidkrevende og kostbar oppgave. Her presenterer vi en protokoll som beskriver i detalj hvordan vi identifiserer de optimale forholdene for uttrykk og rensing av hTRPC3, som oppførte seg dårlig i vår første screening. Vi presenterer flere viktige punkter om hvordan du feilsøker og optimalisere protein atferden, som lå et solid grunnlag for våre cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) studier. Vi bruker en modifisert baculoviral genererer vektor (pEG), utviklet av Gouaux og kolleger, som er optimalisert for screening analyser og effektiv generasjon av baculovirus i pattedyrceller20. Denne uttrykket metoden er egnet for rask og kostnadseffektiv overuttrykte proteiner i pattedyr cellemembranen. Vi kombinerer bruk av denne vektor med en fluorescens-gjenkjenning størrelse-utestenging kromatografi-basert (FSEC) prescreening metoden21. Denne metoden bruker en grønn fluorescerende protein (GFP) koden del Konstruer av interesse og forbedrer visualisering av målet protein i små, hele celler solubilized prøver. Dette gir screening av protein stabilitet i nærvær av ulike vaskemidler og tilsetningsstoffer, thermostabilizing mutasjoner, og tillater bruk av et lite antall celler fra småskala forbigående transfection. På denne måten kan en rekke forhold raskt bli vist før du flytter til en storstilt protein renselse. Følgende uttrykk, screening og rensing presenterer vi en protokoll for å skaffe og bildebehandling fra cryo-EM å generere de novo strukturelle beslutning av protein. Vi tror at metodene som er beskrevet her vil tjene som en generalizable protokoll for strukturelle studier av TRP kanal reseptorer og andre membran proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturelle fastsettelse av proteiner av cryo-EM har revolusjonert strukturell biologi i de siste årene, takket være utviklingen av nye kameraer og algoritmer som betydelig raskere struktur fastsettelse av proteiner som ikke lett krystallklar, spesielt membran proteiner. Til tross for alle den siste utviklingen i cryo-EM teknikken forblir utarbeidelse av renset proteiner tilstrekkelig i kvalitet og kvantitet å lette høykvalitets tenkelig ofte tidkrevende, kostbare og utfordrende. Evne til å raskt uttrykke og skjerm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker G. Zhao og X. Meng for støtte med datainnsamling på David Van Andel avansert Cryo-elektron mikroskopi Suite. Vi takker variabel HPC-teamet for beregningsorientert støtte. Vi gir vår takknemlighet til N. Clemente, D. kontingent, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth og Z. Ruan for kommentarer som forbedret dette manuskriptet. Vi takker D. Nadziejka redaksjonelle støtte for dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av interne variabel finansiering.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
