Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi
Summary
Det här protokollet beskriver tekniker som används för att bestämma ion kanal strukturer av cryo-elektronmikroskopi, inklusive en baculoviridae-systemet som används för att effektivt uttrycka gener i däggdjursceller med minimal ansträngning och toxicitet, protein utvinning, rening, och kvalitet kontroll, grid provberedning och screening, samt insamling och bearbetning.
Abstract
Transient receptor potential kanaler (TRPCs) av kanoniska TRP underfamiljen är icke-selektiva ering kanaler som spelar en viktig roll i kalciumhomeostas, särskilt store manövrerade kalcium inträde, som är avgörande för att upprätthålla korrekt funktion av synaptiskt vesikelprotein release och intracellulära signalsystem. Följaktligen har TRPC kanaler varit inblandade i en rad mänskliga sjukdomar inklusive hjärt-och kärlsjukdomar såsom hjärthypertrofi, neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och neurologiska problem såsom Spinocerebellär ataxi. TRPC kanaler representerar därför en potentiell farmakologisk mål i mänskliga sjukdomar. Molekylära mekanismer för gating i dessa kanaler är dock fortfarande oklart. Svårigheten att få stora mängder stabila, homogen och renat protein har varit en begränsande faktor i struktur bestämning studier, särskilt för däggdjur membranproteiner såsom de TRPC jonkanalerna. Här presenterar vi ett protokoll av storskaliga uttryck för däggdjur ion kanal membranproteiner med en modifierad baculoviridae gen överföringssystem och rening av dessa proteiner genom samhörighet och storlek-utslagning kromatografi. Vi presenterar ytterligare ett protokoll att samla singel-particle kryo-elektron mikroskopi bilder från renat protein och att använda dessa bilder för att avgöra proteinstrukturen. Strukturbestämning är en kraftfull metod för att förstå mekanismer gating och funktion i jonkanaler.
Introduction
Kalcium är involverad i den cellulära processer inklusive signalering kaskader, transkription kontroll, neurotransmitterfrigöraren och hormon molekyl syntes1,2,3. Homeostatiska underhållet av cytosoliska fritt kalcium är avgörande för hälsa och funktion av celler. En av de stora mekanismerna av intracellulära kalcium homeostasen är store manövrerade kalcium inträde (SOCE), en process där utarmning av kalcium lagras i endoplasmatiska nätverket (ER) avtryckarna öppnandet av jonkanaler på plasmamembranet att underlätta den påfyllning av ER kalcium, som sedan kan användas i vidare signalering4,5,6. Transient receptor potential kanaler (TRPCs), som är kalcium-permeable kanaler tillhör överfamiljen TRP, har identifierats som en viktig deltagare i SOCE7,8,9 .
Bland de sju medlemmarna i familjen TRPC, TRPC3, TRPC6 och TRPC7 bildar en homologt undergrupp, och de är unika förmåga att aktiveras av den lipid sekundär budbärare diglyceridolja (DAG), en nedbrytningsprodukt av den signalering lipid fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 uttrycks mycket i glatt muskulatur och i cerebral och cerebellär regioner av hjärnan, där den spelar viktiga roller i Kalciumsignalering som påverkar neurotransmission och neurogenes12,13. Dysfunktion i TRPC3 har varit kopplade till störningar i centrala nervsystemet, hjärt-och kärlsjukdomar och vissa cancerformer såsom cystor adenocarcinom14,15,16. Därför håller TRPC3 löfte som farmaceutisk mål för behandling av dessa sjukdomar. Utvecklingen av riktade läkemedel verkar på TRPC3 har begränsats av en bristande förståelse av dess molekylära aktiveringen mekanismer, däribland lipid bindande platser17,18. Vi har rapporterat första Atom-upplösning struktur den mänskliga TRPC3 kanalen (hTRPC3) och dess två lipid bindningsställen i en sluten stat, som ger viktiga insikter i dessa mekanismer19.
Den viktigaste faktorn för att bestämma strukturen av ett membranprotein med hög upplösning är att få protein av hög kvalitet. Motsvarande screening av uttryck och rening villkor krävs för att uppnå hög kvalitet protein kan vara en tidskrävande och kostsamma strävan. Här presenterar vi ett protokoll som beskriver i detalj hur vi identifiera de optimala förutsättningarna för uttryck och rening av hTRPC3, som uppförde sig dåligt i våra inledande screening. Vi presenterar flera viktiga punkter på hur du felsöker och optimera protein beteendet, som lägger en solid grund för våra cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) studier. Vi använder en modifierad baculoviral genererar vektor (pEG), utvecklat av Gouaux och kollegor, som är optimerad för screening analyser och effektiv generering av baculoviridae i däggdjursceller20. Detta uttryck metod är lämplig för snabba och kostnadseffektiva överuttryck av proteiner i cellmembranet hos däggdjur. Vi kombinerar användandet av denna vektor med en fluorescens-detection storlek-utslagning kromatografi-baserade (FSEC) prescreening metod21. Denna metod använder ett grönt fluorescerande protein (GFP) tag smält till konstruktionen av intresse och förbättrar visualiseringen av målproteinet i små, hela-cell solubilized prover. Detta gör för screening av protein stabilitet i närvaro av olika tvättmedel och tillsatser, med thermostabilizing mutationer, och tillåter användning av ett litet antal celler från småskaliga övergående transfection. På detta sätt kan en mängd villkor snabbt säkerhetskontrolleras innan du flyttar till en storskalig protein rening. Följande uttryck, screening och rening presenterar vi ett protokoll för att erhålla och bildbearbetning från cryo-EM att generera de novo strukturella fastställande av proteinet. Vi anser att de metoder som beskrivs här kommer att fungera som ett generaliserbart protokoll för strukturella studier av TRP kanal receptorer och andra membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturella bestämning av proteiner av cryo-EM har revolutionerat området för strukturbiologi i de senaste åren, tack vare utvecklingen av nya kameror och algoritmer som signifikant påskyndar strukturbestämning av proteiner som inte lätt kristall, särskilt membranproteiner. Trots alla de senaste framstegen inom cryo-EM tekniken förblir beredningen av renade proteiner tillräcklig kvalitet och kvantitet för att underlätta högkvalitativa imaging ofta tidskrävande, kostsamma och utmanande. Förmågan att snabb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar G. Zhao och X. Meng för stöd med datainsamling på David Van Andel avancerade Cryo-elektron mikroskopi Suite. Vi uppskattar det VARI High-Performance Computing teamet för computational stöd. Vi ger vår tacksamhet till N. Clemente, D. avgifter, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth och Z. Ruan för kommentarer som kraftigt förbättrat Detta manuskript. Vi tackar D. Nadziejka för redaktionellt stöd för detta manuskript. Detta arbete stöds av interna VARI finansiering.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
