Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)
Summary
Analyse de la SEM est une méthode efficace pour aider à l’identification des espèces ou discrimination phénotypique. Ce protocole décrit les méthodes pour l’examen des détails morphologiques spécifiques des trois types représentatifs des organismes et serait applicable à l’examen des caractéristiques d’un grand nombre d’organismique et types de tissus.
Abstract
Microscopie électronique (MEB) est une technique largement disponible qui a été appliquée à l’étude des spécimens biologiques allant des protéines individuelles aux cellules, tissus, organelles et même tout l’organisme. Ce protocole se concentre sur deux méthodes de séchage chimiques, hexaméthyldisilazane (HMDS) et t-butanol (TBA) et leur application à l’imagerie d’organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de sem Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Le but du présent protocole est de décrire une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’échantillons qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes pour morphologiques évaluation. La réussite de ce protocole permettra à d’autres d’utiliser SEM pour visualiser des échantillons en appliquant ces techniques à leur système.
Introduction
Un microscope électronique à balayage (SEM) utilise un faisceau focalisé d’électrons de haute énergie pour générer une image à partir d’électrons secondaires qui montre la morphologie et la topographie d’un échantillon de1. SEM peut servir à déterminer directement la taille physique d’un échantillon, la structure de la surface et la forme en trois dimensions et offre une plus grande résolution et de la plus grande profondeur de champ par rapport à la microscopie photonique. Une autre forme de microscopie électronique (me), microscopie électronique à transmission (TEM) utilise des électrons focalisés qui traversent l’échantillon, générant des images avec des détails de structure interne. Tandis que TEM a une résolution supérieure à la lumière ou SEM et peut être utilisée pour résoudre des structures aussi petites que les atomes, il a trois inconvénients majeurs : préparation de l’échantillon vaste, un petit champ de vision et une faible profondeur de champ2,3. Bien qu’autre visualisé il existe des protocoles à l’aide de SEM d’examiner des cellules, tissus ou organites4,5,6,7,8,9, 10 , ce protocole est unique car nous décrivons des méthodes qui peuvent être largement appliquées à un large éventail d’organismes d’évaluation morphologique.
SEM a trouvé des applications larges pour l’examen des matériaux inorganiques, y compris les nanoparticules11,12, polymères,13et nombreuses applications en sciences géologiques, industriels et matériels14, 15,,16. En biologie, SEM a longtemps été utilisé comme une méthode d’examen des échantillons biologiques allant de protéines individuelles à tout les organismes17,18. SEM est une valeur particulière parce que les détails morphologiques de la surface peuvent être utilisés pour informer de la découverte scientifique. Analyse de la SEM est une méthode rapide, peu coûteuse et simple pour obtenir des informations détaillées sur la structure, la taille et des caractéristiques de surface d’une large gamme d’échantillons biologiques.
Car une SEM fonctionne normalement sous vide poussé (10-6 Torr minimum) pour soutenir un faisceau cohérent d’électrons à haute vitesse, aucun des liquides (eau, huiles, alcools) ne sont autorisés dans le compartiment de mesure, liquides à prévenir un vide de se former. Ainsi, tous les échantillons examinés à l’aide de SEM doivent être déshydratés, généralement à l’aide d’une série graduée de l’éthanol suivie d’un procédé de séchage pour éliminer l’éthanol. Il existe plusieurs méthodes de séchage des tissus biologiques devant servir à la SEM, y compris le séchage à l’air, lyophilisation, utilisation d’un dispositif de séchage du point critique (CPD), ou produit chimique séchage en utilisant l’alcool t-butylique (TBA) ou hexaméthyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. le plus souvent, le choix d’une méthode de séchage est empirique puisque chaque échantillon biologique peut-être réagir différemment à chaque méthode de séchage. Pour un échantillon donné, toutes ces méthodes peuvent être appropriées, afin de comparer les avantages et les inconvénients de chacun est utile dans le choix de la méthode appropriée.
Alors qu’un échantillon à la température ambiante ou dans une étuve (60 ° C) de séchage à l’air est la méthode la plus simple, la plupart des échantillons biologiques montrent des dommages causés par le séchage comme ratatinement et s’effondrer, aboutissant à la distorsion de l’échantillon. Le processus de lyophilisation aussi supprime l’eau (ou glace) auprès d’un échantillon, mais nécessite des échantillons congelés flash et mis sous vide pour éliminer la glace via le processus de sublimation, potentiellement endommager l’échantillon. En outre, l’utilisateur doit avoir accès à un lyophilisateur. La méthode la plus couramment utilisée pour la déshydratation des échantillons pour SEM est point critique séchage (CPD). CPD, l’éthanol dans un échantillon est remplacé par liquid dioxyde de carbone (CO2) et, sous une température spécifique et des conditions de pression appelées le point critique (31,1 ° C et 1 073 lb/po2), CO2 se vaporise sans créer de tension superficielle, ce qui maintien efficace les caractéristiques morphologiques et structurales de l’échantillon. Alors que le CPD est généralement la méthode standard, il a plusieurs inconvénients. Tout d’abord, le processus nécessite un accès à un point critique, sèche qui n’est pas seulement coûteux, mais qui nécessite également l’utilisation de dioxyde de carbone liquide. Deuxièmement, la taille de l’échantillon qui peut être séché se limite à la taille de la chambre du point critique sèche. En troisième lieu, l’échange de liquides au cours de la CPD peut provoquer des turbulences qui peuvent endommager l’échantillon.
Le séchage chimique offre de nombreux avantages par rapport aux CPD et sert comme une alternative appropriée devient largement utilisé dans la préparation de l’échantillon SEM. L’utilisation des dehydrants chimiques tels que l’ATB et HMDS offre une alternative rapide, peu coûteuse et simple à d’autres méthodes, tout en conservant l’intégrité structurale de l’échantillon. Récemment, nous avons montré qu’il n’y avait aucun différence dans l’intégrité du tissu ou de la qualité de l’image finale, capturé lors de l’utilisation de la DPC ou TBA comme la méthode de séchage en adulte Drosophila tissu rétinien23. Contrairement à la CPD, TBA et HMDS n’exigent pas un instrument de séchage ou de liquide de CO2 et il n’y a aucune limitation sur la taille de l’échantillon à sécher. En plus d’obtenir les produits chimiques, qu’une hotte chimique standard et l’équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse et des lunettes de sécurité) sont nécessaires pour compléter le processus de séchage. Alors que les deux TBA et HMDS sont inflammable, TBA est moins toxique et moins cher (environ 1/3 du coût de la HMDS) que HMDS.
Dans cet article, nous décrivons comment fixer, laver, déshydrater, sécher, monter, bredouiller manteau et image de trois types d’organismes : les cyanobactéries (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. et un SP inconnue), deux euglènes appartenant au genre Monomorphina (M. aenigmatica et M. pseudopyrum) et la drosophile (Drosophila melanogaster). Ces organismes représentent un large éventail en taille (0,5 µm à 4 mm) et de la diversité cellulaire (unicellulaires à multicellulaires), pourtant tous se prêtent facilement à l’analyse de la SEM avec seulement de légères variations, nécessaires à la préparation des échantillons. Ce protocole décrit les méthodes pour l’utilisation de déshydratation chimique et l’analyse de la SEM pour examiner les détails morphologiques des trois types d’organismes et serait applicable à l’examen des nombreux organismique et types de tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole utilisant SEM afin d’obtenir des informations détaillées sur les caractéristiques morphologiques externes de trois types d’organismes que d’autres peuvent s’appliquer afin d’examiner les caractéristiques de nombreux types d’organismes ou de tissus. À chaque étape du protocole, il y a des points potentiels d’erreur qui peuvent survenir et sont décrits en détail ci-dessous.
Tandis que les volumes pour le fixateur et lavages donnés ici s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention de MLS et une bourse de chercheur de l’été à MAK du bureau de la recherche et des études supérieures à l’Université de Central Michigan. Cyanobactéries ont été fournis par le Zimba et laboratoire de plancton, une partie du centre d’études côtières, Texas A & M University à Corpus Christi. Euglènes ont été fournis par le laboratoire Triemer, Michigan State University.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
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