Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)
Summary
Análisis de SEM es un método eficaz para ayudar en la identificación de las especies o la discriminación fenotípica. Este protocolo describe los métodos para examinar los detalles morfológicos específicos de tres tipos representativos de organismos y sería ampliamente aplicable a examinar características de muchos organismos y tipos de tejidos.
Abstract
Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una técnica ampliamente disponible que se ha aplicado para estudiar a especímenes biológicos que van desde proteínas individuales a las células, tejidos, organelos y organismos incluso todo. Este protocolo se centra en dos métodos de secado químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) y el alcohol t-butílico (TBA) y su aplicación a la proyección de imagen de organismos procarióticos y eucarióticos con SEM. En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El propósito de este protocolo es describir un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de las muestras que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para morfológico evaluación. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a otros utilizar SEM para visualizar muestras aplicando estas técnicas a su sistema.
Introduction
Un microscopio electrónico de barrido (MEB) utiliza un haz enfocado de electrones de alta energía para generar una imagen de electrones secundarios que muestra la morfología y la topografía de una muestra de1. SEM puede utilizarse para determinar directamente el tamaño físico de una muestra, la estructura superficial y la forma tridimensional y ofrece una mayor resolución y mayor profundidad de campo en comparación con microscopia ligera. Otra forma de microscopia electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza electrones enfocados que pasan a través de la muestra, generando imágenes con los detalles finos de la estructura interna. Mientras que TEM tiene mayor resolución que la luz o SEM y puede utilizarse para resolver estructuras tan pequeñas como átomos individuales, tiene tres inconvenientes principales: preparación de la muestra amplia, un pequeño campo de visión y poca profundidad de campo2,3. Aunque otros visualizar protocolos existen uso de SEM para examinar determinados tejidos, células y organelos4,5,6,7,8,9, 10 , este protocolo es el único que se describen métodos que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para la evaluación morfológica.
SEM ha encontrado aplicaciones amplios para examinar materiales inorgánicos incluyendo nanopartículas11,12, polímeros13y numerosas aplicaciones en ciencias geológicas, industrial y material14, 15,16. En biología, SEM ha sido utilizado como un método para examinar muestras biológicas que van desde proteínas individuales a todo organismos17,18. SEM es de valor especial porque detalles morfológicos superficiales pueden utilizarse para informar el descubrimiento científico. Análisis de SEM es un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de una amplia gama de muestras biológicas.
Porque un SEM opera normalmente bajo alto vacío (10-6 Torr mínimo) para apoyar un haz coherente de electrones de alta velocidad, no líquidos (agua, aceites, alcoholes) son permitidos en la cámara de muestras, como líquidos evitar un vacío de formación. Así, todas las muestras examinadas usando SEM deben estar deshidratadas, por lo general mediante una serie gradual de etanol seguida de un proceso de secado para eliminar el etanol. Existen varios métodos de secado de tejidos biológicos para su uso en el SEM, incluyendo el secado, liofilización, uso de un dispositivo de (CPD) secado de punto crítico, o producto químico de secado utilizando el alcohol t-butílico (TBA) o hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. con mucha frecuencia, selección de un método de secado es empírica, ya que cada muestra biológica puede reaccionar diferentemente a cada método de secado. Cualquier muestra dada, todos estos métodos pueden estar apropiados, comparar las ventajas y desventajas de cada uno es útil seleccionar el método apropiado.
Mientras que el aire de secado de una muestra a temperatura ambiente o en un horno de secado (60 ° C) es el método más simple, más muestras biológicas muestran daños de sequía-inducida como arrugamiento y colapsan, dando por resultado la distorsión de la muestra. El proceso de liofilización también quita el agua (o hielo) de una muestra, pero requiere muestras ser flash-congeladas y colocado bajo vacío para quitar el hielo mediante el proceso de sublimación, potencialmente dañar la muestra. Además, el usuario debe tener acceso a un liofilizador. El método más comúnmente utilizado para deshidratar muestras para SEM es punto crítico de secado (CPD). En CPD, se sustituye el etanol en una muestra de líquido dióxido de carbono (CO2) y, bajo condiciones de presión conocidas como el punto crítico (31,1 º C y psi 1.073), CO2 se vaporiza sin crear tensión superficial, de tal modo y temperatura específica efectivamente manteniendo las características morfológicas y estructurales de la muestra. Mientras que el CPD es generalmente el método estándar, tiene varios inconvenientes. En primer lugar, el proceso requiere el acceso a un secador de punto crítico que no sólo es caro, pero también requiere el uso de dióxido de carbono líquido. En segundo lugar, el tamaño de la muestra que puede ser secado se limita al tamaño de la cámara del secador de punto crítico. En tercer lugar, el intercambio de líquidos en CPD puede causar turbulencia que puede dañar la muestra.
Secado químico ofrece muchas ventajas sobre CPD y sirve como una alternativa conveniente que es ser ampliamente utilizada en la preparación de muestras SEM. El uso de químicos dehydrants TBA como HMDS ofrece una alternativa rápida, barata y sencilla que otros métodos, mientras que mantiene la integridad estructural de la muestra. Recientemente demostró que no hubo diferencias en la integridad de los tejidos o la calidad de la imagen final cuando utilizando CPD o TBA como el método de secado en el adulto Drosophila tejido retiniano23. A diferencia de CPD, TBA y HMDS no requieren de un secado de la instrumento o líquido CO2 y no hay ninguna limitación en el tamaño de la muestra a secar. Además de los productos químicos, sólo una campana química estándar y equipos de protección personal (guantes, bata y gafas de seguridad) deben completar el proceso de secado. Mientras tanto TBA como HMDS son inflamables, TBA es menos tóxicos y menos costosos (aproximadamente 1/3 el costo de HMDS) de HMDS.
En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). Estos organismos representan una amplia gama en tamaño (0,5 μm a 4 mm) y la diversidad celular (unicelular a multicelular), sin embargo, todos son fácilmente susceptibles de análisis SEM con sólo pequeñas variaciones es necesarias para la preparación de las muestras. Este protocolo describe los métodos para el uso de deshidratación química y el análisis de SEM para examinar detalles morfológicos de tres tipos de organismos y sería ampliamente aplicable al examen de muchos organismos y tipos de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos descrito un protocolo de uso de SEM para obtener información detallada sobre las características morfológicas externas de los tres tipos de organismos que otros pueden aplicar para examinar características de muchos tipos de organismos o tejidos. Dentro de cada paso del Protocolo, hay posibles puntos de error que pueden surgir y se discuten en detalle más adelante.
Mientras que los volúmenes de fijador y lavado dado aquí son específicos, en general el fijador y lavado debe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención a la MLS y un verano Scholar Award a MAK de la oficina de investigación y estudios de posgrado en la Universidad de Michigan Central. Cianobacterias fueron suministradas por la Zimba y laboratorio de plancton, parte del centro para estudios costeros, Texas A & M University en Corpus Christi. Euglenoides fueron suministrados por el laboratorio Triemer, Universidad Estatal de Michigan.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
References
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
