原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備
Summary
SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3 つの代表的なタイプの菌の形態学的詳細を調べる方法について説明し、多くの個体の特徴を調べることに広く適用されると組織型。
Abstract
走査電子顕微鏡 (SEM) は、個々 のタンパク質から細胞、組織、器官、でも全体の有機体に至るまでの生物的標本を研究に適用されている広く利用可能な技術です。このプロトコルが SEM. を用いた原核生物と真核生物のイメージングへの応用と t-ブチル アルコール (TBA) ヘキサメチルジシラザン (HMDS) 2 つの化学的乾燥方法に焦点を当ててください。この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。このプロトコルの目的は、高速、安価で、シンプルな構造、サイズ、および有機体のための大規模な範囲に広く適用できる標本の表面特性について詳細な情報を取得するメソッドを記述する形態評価。このプロトコルを正常に完了は、他の SEM を使用して彼らのシステムにこれらの技術を適用することによってサンプルを視覚化することができます。
Introduction
走査型電子顕微鏡 (SEM) は、サンプル1の地形と形態を示す二次電子から画像を生成するのに高エネルギー電子の集束ビームを使用します。SEM は、直接サンプル、提供のより高い解像度と表面構造三次元形状の物理サイズと光学顕微鏡と比較してフィールドの大きい深さを決定する使用できます。電子顕微鏡検査 (EM) の別のフォーム、透過型電子顕微鏡 (TEM) は、内部構造の細部のイメージを生成するサンプルを通過集中電子を使用します。TEM 光または SEM より高い解像度があり単一原子のような小さな構造を解決する使用ことができます、それは 3 つの主要な不利な点: 広範なサンプル準備、小さな視野とフィールド2,3の浅い深さ。その他可視化プロトコルが SEM を使用して特定の細胞、細胞小器官や組織4,5,6,7,8,9,を調べる存在する10 、このプロトコルは、固有生物形態学的評価のための大規模な範囲に広く適用することができる方法について述べる。
SEM は、地質、産業、科学、材料14,のナノ粒子11,12, ポリマー13, と多数のアプリケーションを含む無機材料を検査するための広範なアプリケーションを発見した15,16。生物学で、SEM は長い個々 の蛋白質から全体生物17,18に至るまで生物学的サンプルを調べるための方法として使用されています。SEM は、科学的発見を知らせるため表面の形態学的詳細を使用できるため、特定の値が。SEM 解析は、構造、サイズ、および幅広い生体試料の表面特性について詳細な情報を取得する高速、安価で、簡単な方法です。
SEM は、一貫した高速電子ビームをサポートする高真空 (10-6 Torr の最小) の下で通常動作するため液体 (水、油、アルコール) は許可されません試料室の真空が形成するを防ぐ液体として。したがって、SEM を用いてすべてのサンプルは、通常乾燥プロセスによって続く傾斜エタノール シリーズを使用したエタノールを削除、脱水される必要があります。乾燥空気乾燥、凍結乾燥、臨界点乾燥 (CPD) デバイス、または化学 t-ブチル アルコール (未定) またはヘキサメチルジシラザン (HMDS)19、を使用して乾燥の使用など、SEM で使用するため生体組織のいくつかの方法があります。20,21,22. 各生物学的サンプルが異なるそれぞれの乾燥方法に反応するのでほとんどの場合、乾燥方法の選択は経験的。任意の指定されたサンプルのすべてのこれらのメソッドがあります適切な長所とそれぞれの短所を比較することは適切な方法を選択する際に便利ですので。
部屋の温度や乾燥炉 (60 ° C) 試料の乾燥空気は、最も簡単な方法は、ほとんどの生物学的サンプル shriveling など乾燥によるダメージを表示する、折りたたむには、供試体の歪みの結果します。凍結乾燥のプロセスも水 (または氷)、サンプルから削除しますが、フラッシュ凍結サンプルを必要として有害なサンプル、昇華のプロセスを介して氷を削除する真空下に置かれます。さらに、ユーザーは、エアカーテンへのアクセスに必要です。SEM のためのサンプルをステータス退避に最も一般的に使用されるメソッドは、臨界点乾燥 (CPD) です。液体の二酸化炭素 (CO2) と、特定の温度と臨界点 (31.1 ° C、1,073 psi) CO2気化により表面張力を作成せずとして知られている圧力条件の下で、CPD のサンプルでエタノールが置き換えられますサンプルの形態や構造の特徴を効果的に維持します。CPD は、標準的な方法では一般的に、いくつかの欠点があります。最初に、プロセスでは、臨界点乾燥機は高価なだけでなく、また液体の二酸化炭素の使用が必要になりますへのアクセスが必要です。第二に、乾燥することができますサンプルのサイズは、臨界点乾燥機のチャンバー サイズに制限されます。第三に、CPD の中に液体の交換は、サンプルを傷つけることができる乱流を可能性があります。
化学乾燥 CPD に比べて多くの利点を提供しています、SEM 試料の普及に伴い、適切な代替として機能します。未定、HMD など化学の dehydrants の使用は、サンプルの構造の整合性を維持しながら他の方法を高速、安価で、シンプルな代替を提供しています。我々 は最近、組織または大人のショウジョウバエ網膜組織23の乾燥方法として CPD または未定を使用する場合に、最終的な画像品質の整合性の違いがなかったことを示した。CPD とは異なり乾燥器や液体 CO2未定と HMD は必要ありません、乾燥試料のサイズに制限はありません。化学物質を取得、に加えて標準の化学発煙のフードと適切な個人用保護具 (手袋、白衣、安全メガネ) だけは乾燥のプロセスを完了する必要があります。TBA は毒性の少ないより少なく高価な未定と HMD は可燃性ですが、(約 1/3 HMD のコスト) HMD より。
この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。これらの生物は、サイズ (4 mm 0.5 μ m) と (単細胞多細胞に) 細胞の多様性の広い範囲を表すまだすべては、だけ小さな変化が切片作製に必要な SEM 解析へ簡単に従う義務があります。このプロトコルは 3 つのタイプの菌の形態学的詳細を調べます化学脱水と SEM 分析を使用する方法について説明し、多くの生物を調べることに広く適用されると組織型。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで我々 は生物や組織の多くの種類の機能に適用できる他の有機体の 3 種類の外部形態的特性について詳細な情報を取得する SEM を使用してプロトコルを記述しました。プロトコルの各ステップ内では、潜在的なエラーで発生する可能性があり、詳細は以下で説明している点があります。
定着剤と洗浄ここに与えられたボリュームが特定は一般に定着剤と洗浄が試料?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は研究局、セントラル ミシガン大学大学院研究から MAK に MLS と夏学者賞の助成金によって賄われていた。シアノ バクテリアは、沿岸域、テキサス A & M 大学コーパスクリスティの Zimba とプランクトン研究室、センターの一部によって供給されました。Euglenoids は、Triemer の実験室、ミシガン州立大学によって供給されました。
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
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