Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Summary
SEM-Analyse ist eine effektive Methode um Speziesidentifizierung oder phänotypischen Diskriminierung zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Untersuchung der morphologischer Besonderheiten der drei repräsentative Arten von Organismen und zur Untersuchung der Eigenschaften von vielen organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.
Abstract
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist eine verbreitete Technik, die angewendet wurden, um biologische Proben von einzelne Proteine, Zellen, Gewebe, Organellen und sogar ganze Organismen bis hin zu untersuchen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemischen Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazane (HMDS) und t-Butyl-Alkohol (TBA) und deren Anwendung auf Bildgebung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit SEM In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Dieses Protokoll soll beschreiben, eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um erhalten detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit der Exemplare, die im großen und ganzen auf eine große Auswahl an Organismen für angewendet werden können morphologische Bewertung. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls können andere SEM verwenden Proben durch Anwendung dieser Techniken, um ihr System zu visualisieren.
Introduction
Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) nutzt einen fokussierten Strahl von hochenergetischen Elektronen erzeugen ein Bild von Sekundärelektronen, die Morphologie und die Topographie von Beispiel1zeigt. SEM kann verwendet werden, um direkt die physische Größe einer Probe, die Oberflächenstruktur und die dreidimensionale Form, und bietet höhere Auflösung und größere Schärfentiefe im Vergleich zu Lichtmikroskopie bestimmen. Eine andere Form der Elektronenmikroskopie (EM), nutzt Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) fokussierte Elektronen, die durch die Probe, erzeugen Bilder mit feinen Details der internen Struktur übergeben. TEM hat höhere Auflösung als Licht oder SEM und kann verwendet werden, um Strukturen so klein wie einzelne Atome zu lösen, hat es drei große Nachteile: umfangreiche Probenvorbereitung, ein kleines Sichtfeld und einer geringen Tiefe von Feld2,3. Obwohl andere visualisiert Protokolle gibt es mit SEM zu bestimmten Zellen, Organellen oder Gewebe4,5,6,7,8,9, 10 , dieses Protokoll ist einzigartig, da wir Methoden beschreiben, die im großen und ganzen auf eine Vielzahl von Organismen zur morphologischen Beurteilung angewendet werden können.
SEM findet breite Anwendungen für die Prüfung von anorganischer Materialien einschließlich Nanopartikel11,12, Polymere13und zahlreiche Anwendungen in geologischen, industriellen und materiellen Wissenschaften14, 15,16. In der Biologie wurde SEM lange als eine Methode zur Untersuchung von biologischer Proben von einzelnen Proteine bis hin zu ganzen Organismen17,18eingesetzt. SEM ist von besonderem Wert, weil morphologische Oberflächendetails verwendet werden, um wissenschaftliche Entdeckung informieren. SEM-Analyse ist eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit eine Vielzahl von biologischen Proben.
Da ein SEM normalerweise im Hochvakuum (10-6 minimale Torr arbeitet), einen kohärenten Strahl von High-Speed-Elektronen zu unterstützen, dürfen keine Flüssigkeiten (Wasser, Öle, Alkohole) in die Probenkammer, wie Flüssigkeiten ein Vakuum zu verhindern. Somit müssen alle Proben mit SEM untersucht dehydriert werden in der Regel mit einer abgestuften Ethanol-Reihe gefolgt von einem Trocknungsprozess, um das Ethanol zu entfernen. Es gibt mehrere Methoden der Trocknung biologischer Gewebes für den Einsatz in der SEM, einschließlich Lufttrocknung, Gefriertrocknung, Verwendung eines kritischen Punkt Trocknungseinrichtung (CPD) oder chemische Trocknung mit t-Butyl-Alkohol (TBA) oder Hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. in den meisten Fällen Auswahl an einem Trocknungsverfahren ist empirisch, da jede biologische Probe auf jedes Trocknungsverfahren unterschiedlich reagieren kann. Für jede Probe kann all diesen Methoden geeignet also vergleicht die vor- und Nachteile der einzelnen nützlich ist bei der Auswahl der geeigneten Methode.
Während Lufttrocknung eine Probe bei Raumtemperatur oder in einem Trockenschrank (60 ° C) die einfachste Methode ist, die meisten biologische Proben trocknen-induzierten Schäden wie Ausdörrende zeigen und zusammenbrechen, was zu Verzerrungen der Probe. Der Prozess der Lyophilisation entfernt Wasser (oder Eis) aus dem Beispiel, aber erfordert Proben Blitz eingefroren werden und platziert unter Vakuum zu entfernen, das Eis über den Prozess der Sublimation, potenziell schädliche Probe. Darüber hinaus muss der Benutzer über ein Gefriertrockner verfügen. Die am häufigsten verwendete Methode für das Austrocknen von Proben für SEM ist kritischer Punkt trocknen (CPD). In CPD wird das Ethanol in einer Probe mit flüssigem Kohlendioxid (CO2) und unter bestimmten Temperatur- und Druckbedingungen bekannt, da der kritische Punkt (31,1 ° C und 1.073 Psi), CO2 verdampft ohne Oberflächenspannung, wodurch ersetzt effektiv Erhaltung der morphologischen und strukturellen Eigenschaften der Probe. Während der CPD im Allgemeinen die Standardmethode ist, hat es einige Nachteile. Der Prozess erfordert zunächst, Zugang zu einem kritischen Punkt Trockner, die ist nicht nur teuer, sondern erfordert auch die Verwendung von flüssigem Kohlendioxid. Zweitens ist die Größe der Stichprobe, die getrocknet werden kann auf die Kammergröße des kritischen Punktes Trockner beschränkt. Drittens kann der Austausch von Flüssigkeiten während der CPD Turbulenzen verursachen, die die Probe beschädigen können.
Chemische Trocknung bietet viele Vorteile gegenüber CPD und dient als eine geeignete Alternative, die in SEM Probenvorbereitung verbreitet werden. Die Verwendung von chemischen Dehydrants wie TBA und HMD bietet eine schnelle, preiswerte und einfache Alternative zu anderen Methoden, unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der Probe. Wir haben vor kurzem gezeigt, es keinen Unterschied in die Integrität des Gewebes oder die Qualität des fertigen Bildes erfasst gab bei der Verwendung von CPD oder TBA als Trocknungsverfahren in Erwachsenen Drosophila Netzhautgewebe23. Im Gegensatz zu CPD TBA und HMD erfordern keine Trocknung Instrument oder flüssiges CO2 und es gibt keine Beschränkung der Größe der Stichprobe, die getrocknet werden. Neben die Chemikalien, sind nur ein standard chemische Dampfhaube und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe und Kittel) erforderlich, um den Trocknungsprozess zu vervollständigen. TBA und HMD brennbar sind, TBA ist weniger giftig und weniger teuer (ca. 1/3 der Kosten des HMDS) als HMD.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Diese Organismen repräsentieren ein breites Spektrum an Größe (0,5 µm bis 4 mm) und zelluläre Vielfalt (einzellige, mehrzelligen), doch alles sind SEM-Analyse leicht zugänglicher mit nur kleinen Variationen für Probenvorbereitung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden für die Verwendung von chemischen Dehydrierung und SEM Analyse um morphologische Details der drei Arten von Organismen zu untersuchen und zu prüfen viele organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir ein Protokoll mit SEM detaillierte Informationen über externe morphologischen Charakteristika der drei Arten von Organismen, die anderen anwenden können, um Eigenschaften von vielen Arten von Organismen oder Gewebe zu untersuchen. In jedem Schritt des Protokolls gibt es mögliche Punkte der Fehler, der auftreten und werden nachfolgend ausführlich erläutert.
Während die Volumina für Fixiermittel und Waschungen, die hier gegeben sind, sollte im allgemeinen Fixiermittel und W…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss an MLS und ein Sommer Scholar Award, MAK aus dem Office of Research und Graduate Studies an der Central Michigan University finanziert. Cyanobakterien waren von der Zimba und Plankton Lab, Teil des Zentrums für Coastal Studien, Texas A & M University an Fronleichnam bereitgestellt. Euglenoids wurden von Triemer Lab, Michigan State University geliefert.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
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