Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)

Summary

SEM er en effektiv metode for å hjelpe i arter identifikasjon eller fenotypiske diskriminering. Denne protokollen beskriver metodene for å undersøke bestemte morfologiske detaljer av tre representant organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke funksjonene i mange organismebiologi og vev.

Abstract

Skanning elektronmikroskop (SEM) er en allment tilgjengelig teknikk som brukes for å studere biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til celler, vev, organeller og hele organismer. Denne protokollen fokuserer på kjemiske drying metodene, hexamethyldisilazane (HMDS) og t-butyl alkohol (TBA) og deres bruk bildebehandling av både prokaryotic og eukaryotic organismer med SEM. I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokollen er å beskrive en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner prøver som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer for morfologiske vurdering. Vellykket gjennomføring av denne protokollen vil tillate andre å bruke SEM for å visualisere prøver ved å bruke disse teknikkene på deres system.

Introduction

En scanning elektron mikroskop (SEM) bruker en fokusert stråle av kraftkrevende elektroner generere et bilde fra videregående elektroner som viser morfologi og topografi eksempel¹. SEM kan brukes til direkte bestemmer den fysiske størrelsen av en prøve, overflatestruktur, tredimensjonal form, og tilbyr større oppløsning og større dybdeskarphet sammenlignet * lys. En annen form for elektronmikroskop (EM), overføring elektronmikroskop (TEM) bruker fokusert elektroner som passerer gjennom utvalget, genererer bilder med fine detaljer av intern struktur. Mens TEM har høyere oppløsning enn lys eller SEM og kan brukes til å løse strukturer så liten som enkelt atomer, har tre store ulemper: omfattende utvalg forberedelse, en liten synsfelt og en grunne dybde på feltet^2,3. Selv om andre visualisert protokoller eksisterer ved hjelp av SEM undersøke bestemte celler, organeller eller vev^{4,5,6,7,8,9, 10} , denne protokollen er unik i at vi beskriver metoder som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer morfologiske vurdering.

SEM har funnet bred programmer for å undersøke uorganisk materiale inkludert nanopartikler^11,12, polymerer¹³og mange programmer i geologiske, industrielle og materielle vitenskap^{14, 15,16}. I biologi, har SEM lenge vært brukt for å undersøke biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til hele organismer^17,18. SEM er av spesiell verdi fordi morfologiske detaljer fra overflaten kan brukes til å informere vitenskapelige funn. SEM er en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner et bredt spekter av biologiske prøver.

Fordi en SEM normalt opererer under høyvakuum (10^-6 Torr minimum) å støtte en sammenhengende stråle av høyhastighets elektroner, tillates ingen væske (vann, oljer, alkoholer) i eksemplet kammeret, som væsker hindre et vakuum dannes. Således, alle prøver undersøkt ved hjelp av SEM må bli dehydrert vanligvis bruke en gradert etanol serie etterfulgt av en tørkeprosessen fjerne etanol. Det finnes flere metoder for tørking biologisk vev for bruk i SEM, inkludert luft tørker, lyophilization, bruk av et kritisk punkt tørking (CPD) enhet eller kjemiske tørking t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)^{19, 20 , 21 , 22}. oftest utvalg av tørking metode er empirisk siden hvert biologiske utvalg kan reagere forskjellig på hver tørking metode. For enhver gitt prøven, alle disse metodene vil være riktig så sammenligne fordeler og ulemper av hver er nyttig i å velge den riktige metoden.

Air tørking et utvalg ved romtemperatur eller i tørking ovn (60 ° C) er den enkleste metoden, de fleste biologiske prøver viser tørking-indusert skade som shriveling og kollaps, som resulterer i forvrengning av prøven. Prosessen med lyophilization også fjerner vann (eller is) fra en prøve, men krever å være flash-frosne og plassert under vakuum fjerne is via prosessen med sublimering, potensielt skadelige prøven. I tillegg må brukeren ha tilgang til en lyophilizer. Den vanligste metoden for dehydrating prøver for SEM er kritisk punkt tørking (CPD). CPD, er etanol i en prøve erstattet med flytende karbondioksid (CO₂), og under bestemte temperatur og trykk forhold kjent som kritisk punkt (31,1 ° C og 1073 psi), CO₂ fordamper uten å opprette overflatespenning, og dermed effektivt opprettholde de morfologiske og strukturelle funksjonene av utvalget. CPD er vanligvis standard metode, har den flere ulemper. Først krever prosessen tilgang til et kritisk punkt tørketrommel, som er ikke bare dyrt, men også nødvendiggjør bruk av flytende karbondioksid. Andre er størrelsen på prøven som kan tørkes begrenset til kammeret størrelsen på det kritiske punktet tørketrommel. Tredje, utveksling av væsker under CPD kan forårsake turbulens som kan skade prøven.

Kjemisk tørking gir mange fordeler over CPD og fungerer som et egnet alternativ som er blitt mye brukt i SEM eksempel forberedelse. Bruk av kjemiske dehydrants som TBA og HMDS tilbyr en rask, billig og enkelt alternativ til andre metoder, samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til prøven. Vi har nylig viste at det var ingen forskjell i integriteten til vev eller kvaliteten på det endelige bildet tatt når du bruker CPD eller TBA som tørking metode i voksen Drosophila netthinnen vev²³. I motsetning til CPD, TBA og HMDS krever ikke en tørking instrument eller flytende CO₂ , og det er ingen begrensning på størrelsen på utvalget å. I tillegg til å skaffe kjemikalier, må et standard kjemiske avtrekksvifte og riktig personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) fullføre tørkeprosessen. Mens både TBA og HMDS er brannfarlig, TBA er mindre giftig og billigere (ca 1/3 kostnaden for HMDS) enn HMDS.

I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Disse organismene representerer et bredt spekter (0,5 µm 4 mm) og mobilnettet mangfold (encellede til flercellet), men alle er lett mottakelig for SEM analyse med kun små variasjoner nødvendig for prøven forberedelse. Denne protokollen beskriver metodene for å bruke kjemiske dehydrering og SEM analyse for å undersøke morfologiske detaljene av tre typer organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke mange organismebiologi og vev.

Protocol

1. forberedelse og fiksering Forberede Cyanobakterie. Vokser unialgal kulturer i F/2 media24,25 ved en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h lys mørke syklus. Overføre tilstrekkelig kultur til en 1,5 mL microcentrifuge rør slik at etter at 15 min å avgjøre, bakteriell pellets er omtrent 0,05 mL i størrelse. Fjerne media og erstatte med 1,5 mL bindemiddel (1,25% glutaraldehyde, 0.1 M fosfat buffer pH 7.0), forsiktig Inverter flere ganger og…

Representative Results

Cyanobakterie er en prokaryote organismer som er kritiske til globale karbon, oksygen og nitrogen sykluser28,29. Av anslått 6000 arter av Cyanobakterie30, de fleste har en Slim skjede som dekker og koble cellene sammen og andre strukturer31, som sammen med figuren, kan løses mikroskopisk32. Cellestørrelse, form og pigmenter finnes skille individuelle arter …

Discussion

Her beskrev vi en protokoll som SEM for å få detaljert informasjon om eksterne morfologiske kjennetegn av tre typer organismer som andre kan bruke til å undersøke funksjonene i mange typer organismer eller vev. I hvert trinn av protokollen er det steder feil som kan oppstå og diskuteres i detalj nedenfor.

Mens volumene for bindemiddel og vasker gitt her er bestemt, skal generelt bindemiddel og vasker 5-10 x volumet av prøven. Fiksering, vask og dehydrering tidene er basert på vår erfar…

Materials

gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given – see link
AF6 media	Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given – see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given – see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer