Beredning av prokaryota och eukaryota organismer använder kemisk torkning för Morfologisk analys i svepelektronmikroskopi (SEM)
Summary
SEM analys är en effektiv metod till stöd i artbestämning eller fenotypiska diskriminering. Detta protokoll beskriver metoder för att undersöka specifika morfologiska Detaljer av tre representativa typer av organismer och skulle vara allmänt tillämpliga på att undersöka funktioner i många organismer och vävnadstyper.
Abstract
Svepelektronmikroskopi (SEM) är en allmänt tillgänglig teknik som har använts för att studera biologiska prover alltifrån enskilda proteiner till celler, vävnader, organeller och även hela organismer. Detta protokoll fokuserar på två kemiska torkningsmetoder, hexamethyldisilazane (HMDS) och t-butyl alkohol (TBA) och deras tillämpning på imaging både prokaryota och eukaryota organismer med SEM. I den här artikeln beskrivs hur man fixa, tvätta, torka, torka, montera, sputter kappa och bild tre typer av organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. och en okänd sp.), två euglenoids från släktet Monomorphina (M. aenigmatica och M. pseudopyrum), och bananflugan (Drosophila melanogaster). Syftet med detta protokoll är att beskriva en snabb, billig och enkel metod för att få detaljerad information om struktur, storlek och ytegenskaper av exemplar som i stort sett kan tillämpas på ett stort antal organismer för morfologisk bedömning. Framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att tillåta andra att använda SEM för att visualisera prover genom att tillämpa dessa tekniker på deras system.
Introduction
Ett svepelektronmikroskop (SEM) använder en fokuserade strålen av high-energy elektroner för att generera en bild från sekundära elektroner som visar morfologi och topografin av en prov1. SEM kan användas för att direkt avgöra den fysiska storleken på ett prov, ytstrukturen, och tredimensionell form, och erbjuder högre upplösning och större skärpedjup jämfört med ljusmikroskop. En annan form av elektronmikroskopi (EM), transmissionselektronmikroskopi (TEM) använder fokuserad elektroner som passerar genom provet, generera bilder med fina detaljer av inre struktur. Medan TEM har högre upplösning än ljus eller SEM och kan användas för att lösa strukturer så liten som enda atomer, den har tre stora nackdelar: omfattande provberedning, ett litet synfält och ett grunt djup av fält2,3. Även om andra visualiseras protokoll finns använda SEM för att undersöka specifika celler, organeller eller vävnader4,5,6,7,8,9, 10 , detta protokoll är unikt genom att vi beskriver metoder som kan tillämpas i huvudsak på ett stort antal organismer för morfologisk bedömning.
SEM har funnit bred applikationer för prövningen av oorganiska material inklusive nanopartiklar11,12, polymerer13och talrika applikationer i geologiska, industriella och material sciences14, 15,16. I biologi, har SEM länge använts som en metod för att undersöka biologiska prover alltifrån enskilda proteiner till hela organismer17,18. SEM är särskilt värdefulla eftersom morfologiska yta detaljer kan användas för att informera vetenskapliga upptäckter. SEM analys är en snabb, billig och enkel metod att få detaljerad information om struktur, storlek och ytegenskaper av ett brett spektrum av biologiska prover.
Eftersom en SEM fungerar normalt under hög vakuum (10-6 Torr minsta) att stödja en sammanhängande stråle av snabba elektroner, tillåts inga vätskor (vatten, oljor, alkoholer) i provkammaren, som vätskor att förhindra att vakuum bildas. Alltså, alla prover granskas med hjälp av SEM måste vara uttorkad, vanligtvis med hjälp av en graderad etanol serie därefter en torkningsprocess för att avlägsna etanolen. Det finns flera metoder för torkning av biologiska vävnader för användning i SEM, inklusive lufttorkning, frystorka den, användning av en kritisk punkt torkning (CPD) enhet eller kemisk torkning med hjälp av t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftast, val av en torkning metod är empiriska eftersom varje biologiska prov kan reagera annorlunda på varje torkning metod. För varje givet prov, kan alla dessa metoder vara lämpligt, så att jämföra fördelar och nackdelar av varje är användbar i att välja lämplig metod.
Lufttorkning prov i rumstemperatur eller i torkugn (60 ° C) är den enklaste metoden, de flesta biologiska prover visar torkning-inducerad skada såsom shriveling och kollaps, vilket leder till snedvridning av preparatet. Processen att frystorka den också tar bort vatten (eller is) från ett prov, men kräver prover vara flash-fryst och placeras under vakuum för att ta bort is via processen för sublimering, potentiellt skadliga provet. Dessutom måste användaren ha tillgång till en lyophilizer. Den vanligaste metoden för uttorkande prover för SEM är kritisk punkt torkning (CPD). CPD, ska etanolen i ett prov ersättas med flytande koldioxid (CO2) och, under särskilda temperaturen och trycket villkor kallas den kritiska punkt (31,1 ° C och 1 073 psi), CO2 förångar utan att skapa ytspänning, därmed att effektivt upprätthålla de morfologiska och strukturella funktionerna av provet. Fortbildning är generellt standardmetoden, har men flera nackdelar. Första kräver processen åtkomst till en kritisk punkt torktumlare, vilket är inte bara dyrt, men kräver också användningen av flytande koldioxid. För det andra är storleken på provet som kan torkas begränsad till kammaren storleken på den kritiska punkten torktumlare. För det tredje, utbyte av vätskor under CPD kan orsaka turbulens som kan skada provet.
Kemisk torkning erbjuder många fördelar jämfört med CPD och fungerar som ett lämpligt alternativ som blir allmänt används i SEM provberedning. Användning av kemiska dehydrants såsom TBA och HMDS erbjuder ett snabbt, Billigt och enkelt alternativ till andra metoder, samtidigt bibehålla den strukturella integriteten av provet. Vi visade nyligen att det var ingen skillnad i vävnaden eller kvaliteten på den slutliga bilden som fångas när du använder CPD eller TBA som metoden torkning i vuxen Drosophila näthinnevävnad23. Till skillnad från CPD, TBA och HMDS kräver inte ett snabbtorkande instrument eller flytande CO2 och det finns ingen begränsning på storleken av provet torkas. Förutom att få kemikalier, krävs endast en standard kemiska spiskåpa och lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, laboratorierock och skyddsglasögon) för att slutföra torkningen. Medan både TBA och HMDS är brandfarliga, TBA är mindre giftiga och billigare (ca 1/3 kostnaden för HMDS) än HMDS.
I den här artikeln beskrivs hur man fixa, tvätta, torka, torka, montera, sputter kappa och bild tre typer av organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. och en okänd sp.), två euglenoids från släktet Monomorphina (M. aenigmatica och M. pseudopyrum), och bananflugan (Drosophila melanogaster). Dessa organismer utgör ett brett utbud i storlek (0,5 µm till 4 mm) och cellulära mångfald (encelliga till flercelliga), men alla är enkelt mottagliga för SEM analys med endast små variationer behövs för prov förberedelse. Detta protokoll beskriver metoder för att använda kemiska uttorkning och SEM analys för att undersöka morfologiska Detaljer för tre typer av organismer och skulle vara allmänt tillämpliga på att undersöka många organismer och vävnadstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs vi ett protokoll som använder SEM för att erhålla detaljerad information om externa morfologiska kännetecken av tre typer av organismer som andra kan använda för att undersöka funktioner av många typer av organismer eller vävnader. Inom varje steg av protokollet finns det potentiella punkter av fel som kan uppstå och diskuteras i detalj nedan.
Medan volymerna för fixativ och tvättar som ges här är specifika, bör i allmänhet den fixativ och tvättar vara 5-10 gång…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades genom ett bidrag till MLS och en sommar Scholar Award till MAK från kontor för forskning och forskarutbildning vid Central Michigan University. Cyanobakterier levererades av Zimba och plankton lab, del av centrum för kustnära studier, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids levererades av Triemer lab, Michigan State University.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
References
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
