Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Summary

SEM analyse is een effectieve methode om te helpen bij de identificatie van soorten of fenotypische discriminatie. Dit protocol beschrijft de methoden voor de behandeling van specifieke morfologische details van drie representatieve soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van functies van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Abstract

Scanning elektronen microscopie (SEM) is een algemeen beschikbare techniek die is toegepast om te bestuderen van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot cellen, weefsels, organellen en zelfs hele organismen. Dit protocol is gericht op twee chemische drogen methoden, hexamethyldisilazane (HMDS) en t-butylalcohol (TBA), en hun toepassing aan imaging van zowel prokaryote en eukaryote organismen met behulp van SEM. In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een snelle, goedkope en eenvoudige methode voor het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte kenmerken van specimens die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling. Succesvolle afronding van dit protocol zal toestaan dat anderen te gebruiken SEM te visualiseren van monsters door deze technieken toe te passen aan hun systeem.

Introduction

Een gerichte lichtbundel van hoog-energetische elektronen een Scannende Elektronen Microscoop (SEM) gebruikt voor het genereren van een afbeelding van secundaire elektronen die toont de morfologie en de topografie van een monster¹. SEM kan worden gebruikt om rechtstreeks bepalen de fysieke omvang van een steekproef, de oppervlaktestructuur, driedimensionale vorm, en het biedt grotere resolutie en grotere diepte van het veld ten opzichte van de lichte microscopie. Een andere vorm van elektronenmicroscopie (EM), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) gebruikt gerichte elektronen die passeren van het monster, afbeeldingen met fijne details van interne structuur te genereren. Terwijl TEM hogere resolutie dan licht of SEM heeft en kan worden gebruikt om op te lossen structuren zo klein als enkele atomen, heeft drie grote nadelen: uitgebreide monstervoorbereiding, een kleine gezichtsveld en een ondiepe diepte van veld^2,3. Hoewel andere gevisualiseerd protocollen bestaan met behulp van SEM te bestuderen van specifieke weefsels, cellen en organellen^{4,5,6,7,8,9, 10} , dit protocol is uniek in die zin dat we beschrijven methoden die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling.

SEM heeft brede toepassingen voor de behandeling van anorganische materialen met inbegrip van nanodeeltjes^11,12, polymeren¹³en talrijke toepassingen in geologische, industriële en materiële wetenschappen^14, gevonden ^15,16. In de biologie, heeft SEM lange tijd gebruikt als een methode voor de behandeling van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot hele organismen^17,18. SEM is van bijzonder belang omdat morfologische oppervlak details kunnen worden gebruikt om wetenschappelijke ontdekking. SEM analyse is een snelle, goedkope en eenvoudige methode om het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte van de kenmerken van een breed scala van biologische monsters.

Omdat een SEM normaal onder hoog vacuüm (10^-6 Torr minimale opereert) ter ondersteuning van een coherente lichtstraal high-speed elektronen, zijn geen vloeistoffen (olie, water, alcoholen) toegestaan in de monsterkamer, zoals vloeistoffen te voorkomen een vacuüm oprichten dat. Aldus, moeten alle monsters onderzocht met behulp van SEM worden gedehydrateerde, meestal met behulp van een reeks van de gesorteerde ethanol gevolgd door een droogprocédé te verwijderen van de ethanol. Er zijn verschillende methoden voor het drogen van biologische weefsels voor gebruik in de SEM, met inbegrip van lucht drogen, lyofilisatie, gebruik van een kritisch punt drogen (CPD) apparaat, of chemische drogen met behulp van de t-butylalcohol (TBA) of hexamethyldisilazane (HMDS)^{19, 20 , 21 , 22}. selectie van een droogrek methode is meestal empirische aangezien elk biologische monster verschillend op elke drogen methode reageren kan. Voor elk monster, kan al deze methoden passend zijn, dus het vergelijken van de voor- en nadelen van elk nuttig is in het selecteren van de juiste methode.

Terwijl lucht drogen een monster bij kamertemperatuur of in een droogstoof (60 ° C) de eenvoudigste methode is, meeste biologische monsters Toon drogen-veroorzaakte schade zoals shriveling en instorten, wat resulteert in een verstoring van het model. Het proces van lyofilisatie ook water (of ijs) verwijdert uit een monster, maar vereist te worden flash-bevroren monsters en onder vacuüm te verwijderen het ijs via het proces van sublimatie, potentieel schadelijke het monster geplaatst. Bovendien moet de gebruiker beschikken over een lyophilizer. De meest gebruikte methode voor het drogen van de monsters voor SEM is kritisch punt drogen (CPD). In CPD, wordt de ethanol in een monster vervangen met vloeibare kooldioxide (CO₂) en, onder specifieke temperatuur en druk voorwaarden bekend als het kritische punt (31.1 ° C en 1,073 psi), CO₂ verdampt zonder het maken van de oppervlaktespanning, waardoor effectief handhaven de morfologische en structurele kenmerken van de steekproef. Terwijl CPD over het algemeen de standaardmethode is, heeft meerdere nadelen. Ten eerste, het proces vereist toegang tot een kritisch punt droger, die is niet alleen duur, maar ook noodzakelijk het gebruik van vloeibare kooldioxide. Ten tweede, de grootte van de steekproef die kan worden gedroogd is beperkt tot de grootte van de kamer van het kritieke punt droger. Ten derde kan de uitwisseling van vloeistoffen tijdens CPD turbulentie die schade aan het monster toebrengen kan.

Chemische droging biedt vele voordelen ten opzichte van de BPR en fungeert als een geschikt alternatief dat steeds wijd in de bereiding van de monsters van de SEM gebruikt is. Het gebruik van chemische dehydrants zoals TBA en HMDS biedt een snel, goedkoop en eenvoudig alternatief voor andere methoden, terwijl nog het handhaven van de structurele integriteit van het monster. We onlangs bleek dat er geen verschil in de integriteit van het weefsel of de kwaliteit van het uiteindelijke beeld gevangen genomen toen met CPD of TBA als de drogen methode in volwassen Drosophila retinale weefsel²³was. In tegenstelling tot de CPD, TBA en HMDS hoeft niet een droogrek instrument of vloeibare CO₂ en er is geen beperking op de grootte van de steekproef worden gedroogd. Naast het verkrijgen van de chemicaliën, zijn alleen een standaard chemische zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril) vereist om te voltooien van het droogproces. Terwijl zowel de HMDS als de TBA ontvlambaar zijn, TBA minder giftig en minder duur is (ongeveer 1/3 de kosten van HMDS) dan HMDS.

In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Deze organismen vertegenwoordigen een breed scala in omvang (0,5 µm tot 4 mm) en cellulaire verscheidenheid (eencellige aan meercellige), maar allemaal gemakkelijk vatbaar voor SEM analyse met slechts kleine variaties die nodig zijn voor de voorbereiding van het monster. Dit protocol beschrijft de methoden voor het gebruik van chemische uitdroging en SEM analyse te onderzoeken van morfologische details voor drie soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Protocol

1. voorbereiding en fixatie Bereiden van cyanobacteriën. Grow eensoortige culturen in F/2 media24,25 bij een temperatuur van 28 ° C op een 14:10 h licht donker cyclus. Overbrengen in voldoende cultuur een 1,5 mL microcentrifuge buis zodanig dat na het toestaan van 15 min te regelen, de bacteriële pellet ongeveer 0,05 mL in grootte. Verwijder het medium en vervangen met 1,5 mL fixeer (1,25% Glutaaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7.0), voorzic…

Representative Results

Blauwalgen zijn een prokaryote groep van organismen die essentieel voor de mondiale koolstof, zuurstof en stikstof cycli28,29 zijn. Van de geschatte 6000 soorten cyanobacteriën30, de meeste hebben een mucilaginous omhulsel dat dekken en de cellen met elkaar verbinden en aan andere structuren31, die samen met de vorm, kunnen worden opgelost microscopisch32. Ce…

Discussion

We beschreven hier een protocol met behulp van SEM voor gedetailleerde informatie over externe morfologische kenmerken van drie soorten organismen die anderen toepassen kunnen om de functies van veel soorten organismen of weefsels te onderzoeken. Binnen elke stap van het protocol zijn er potentiële punten van fout die zich kunnen voordoen en worden besproken in detail besproken.

Terwijl de volumes voor fixeer en wast hier gegeven specifieke zijn, moet in het algemeen de fixeer en wast 5-10 x …

Materials

gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given – see link
AF6 media	Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given – see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given – see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer