Diagnosticering af Hirschsprungs sygdom ved immunofarvning rektal suge biopsier for Calretinin, S100 protein og protein gen produkt 9,5
Summary
Denne protokol beskriver processen med immunofarvning rektal suge biopsier for calretinin, S100 protein, og protein gen produkt 9,5. Denne roman adjuverende diagnostisk metode for Hirschsprungs sygdom har at foretrække følsomhed og specificitet satser.
Abstract
Hirschsprungs sygdom (HD) er en medfødt tarmsygdom, der er klinisk manifesteret som en manglende evne til at passere blandet mekoniumprøve udtaget hos spædbørn eller som langvarig forstoppelse hos børn. Rektal sugebiopsi (RSB) til bestemmelse af fravær af ganglion celler og neurale hypertrofi er den mest præcise test til diagnosticering af HS i øjeblikket. Traditionel hæmatooxylin-eosin farvning mangler følsomhed og specificitet. Acetylcholinesterase farvning kan ikke være almindeligt anvendt på grund af sin komplekse proces. Vores roman protokol af immun farvning for calretinin, S100 protein, og protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5), som vi udførte på RSBs, udviser høj følsomhed og specificitet satser på 96,49% (95% konfidensinterval, 0,88-0,99) og 100% (95% tillid interval, 0,97-1,00). De HD-påvirkede segmenter ofte til stede som fraværet af udtrykket calretinin, S100 protein, og PGP 9.5, som er markører for neurale hypertrofi i submucosavævet væv. Denne protokol beskriver den detaljerede drifts proces for denne nye diagnosemetode.
Introduction
Hirschsprungs sygdom (HD) er en almindelig medfødt tarmsygdom karakteriseret ved mangel på ganglion celler i forskellige segmenter af den distale tarmkanalen1. Det humane enteriske nervesystem dannes, når invasionen af de embryonale neurale celler er afsluttet. Hvis der er en forstyrrelse af processen og invasionen undlader at fuldføre, den distale tarm af den nyfødte bliver aganglionic2. Denne potentielt dødelige tilstand kaldes Hirschsprungs sygdom. Spredning, motilitet, og tarm vækst er de tre vigtigste elementer i vellykket kolonisering.
Traditionelle hæmatatoxylin og eosin (H & E) farvning af en begrænset submucosavævet biopsi kan ikke opnå så tilfredsstillende resultat som H & E farvning af et væv af fuld tykkelse opnået ved kirurgi. Desuden, acetylcholinesterase (AChE) farvning af rektal sugevæv er teoretisk udfordrende på grund af sin utilstrækkelige følsomhed, som er 91%, og kompleks forarbejdning af frosne afsnit3,4. Flere andre immunohistokemiske markører af ganglion celler og nervefibre, der kan farves i formalin-faste og paraffin-indlejrede prøver er gradvist ved at blive mainstream HD diagnostik. Calretinin er et vitamin D-afhængigt calcium bindende protein, der ikke udtrykkes i den myenteriske og submucosale plexus af HS-påvirkede segmenter5. S100 protein udtrykkes i celler afledt af neurale crest, såsom nervefibre og gliale celler, som ofte præsenterer neurale hypertrofi i submucosale væv af HS-påvirkede segmenter6. Protein genprodukt 9,5 (PGP 9.5) pålideligt pletter nervefibre og ganglion celler; PGP 9.5 farvning fungerer som et supplement til calretinin farvning, især i tilfælde af isolerede hypoganglionosis. Dobbelt farvning med S100 og PGP 9.5 kan mindske den falsk-negative hastighed og øge følsomheden. Som en forudsætning har den nuværende undersøgelse til formål at sikre tilstrækkelig specificitet og høj følsomhed af denne nye diagnosemetode. Vores roman protokol brugte alle tre markører for forskelsbehandling af aganglioniske tarm og hypertrofisk nervefibre. En prospektiv undersøgelse af 318 børn blev udført af vores laboratorium og tidligere udgivet uden en detaljeret protokol7. Den detaljerede protokol og forholdsregler er beskrevet i denne artikel. Nyfødte, der har lidt et alvorligt afføring, siden fødslen eller børn med kronisk forstoppelse, bortset fra andre almindelige sygdomme, er potentielle kandidater til rektal sugebiopsi (RSB). Vores roman protokol er velegnet til farvning ikke kun RSBs, men også fuld-tykkelse biopsier eller kirurgiske prøver til at foretage en endelig diagnose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en procedure, hvor der blev brugt tre forskellige immunohistokemiske antistoffer til at plette RBS-sektioner til diagnosticering af HS. Følsomheden af vores diagnostiske protokol var 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), og specificiteten var 100% (95% CI, 0,97-1,00).
De mest kritiske trin i protokollen er RSB og antigen-antistof reaktion. Størrelsen af Biopsien afgør nøjagtigheden af farvning. En lille biopsi vil ikke give nok væv til at foretage en præcis diagnose, mens en stor bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Weibing tang for hans store hjælp med at levere optagelserne Lab. Denne artikel er støttet af den offentlige Velfærdsforskning, og særlige midler blev modtaget fra den nationale sundhed og familieplanlægning i Kina (Grant No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
