Calretinin の免疫染色を行う直腸吸引生検によるヒルシュスプルング病の診断, S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物9.5
Summary
このプロトコルは、calretinin、S100 タンパク質、およびタンパク質遺伝子産物9.5 に対する免疫染色の直腸吸引生検のプロセスを記載している。ヒルシュスプルング病のためのこの新しいアジュバント診断法は、好ましい感受性および特異性率を有する。
Abstract
ヒルシュスプルング病 (HD) は、乳児の胎便を通過することができない、または小児の長期便秘として臨床的に明らかにされている先天性腸疾患である。神経節細胞および神経肥大の不在を決定する直腸の吸引のバイオプシー (RSB) は現時点で HD の診断のための最も正確なテストである。従来のヘマトキシリン・エオシン染色は感受性および特異性に欠ける。アセチルコリンエステラーゼ染色は、その複雑なプロセスのために広く使用することはできません.我々が RSBs で行った calretinin、S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) のための免疫染色の新規プロトコルは、96.49% (95% 信頼区間、0.88-0.99) の高感度および特異性率を示し、100% (95% 信頼間隔は 0.97 ~ 1.00) です。HD に影響を受けるセグメントは、calretinin、S100 タンパク質、および粘膜下組織の神経肥大のマーカーである PGP 9.5 の発現が存在しないとしてしばしば存在する。このプロトコルは、この新しい診断方法の詳細な動作プロセスについて説明します。
Introduction
ヒルシュスプルング病 (HD) は、遠位腸管1の異なるセグメントにおける神経節細胞の欠乏によって特徴付けられる一般的な先天性腸疾患である。ヒトの腸神経系は、胚性神経細胞の浸潤が完了したときに形成される。プロセスの乱れがあり、侵襲が完了しなかった場合、新生児の遠位腸管は aganglionic2になる。この潜在的に致命的な状態はヒルシュスプルング病と呼ばれます。増殖、運動性、および腸の成長は、コロニー形成の成功の3つの主要な要素である。
限定された粘膜下生検の伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色は、手術から得られる全厚組織の H & E 染色としての結果に満足できるものとして達成することができない。さらに、直腸の吸引のティッシュのアセチルコリンエステラーゼ (痛み) の染色は 91%、および凍結セクション3,4の複雑な処理である不十分な感受性が原因で理論的に挑戦的である。ホルマリン固定およびパラフィン包埋標本で染色されることができる神経節細胞および脳繊維の他のいくつかの免疫組織化学的マーカーは、徐々に主流の HD 診断になってきている。Calretinin は、HD 罹患セグメント5の myenteric および粘膜下叢において発現されていないビタミン D 依存性カルシウム結合性タンパク質である。S100 タンパク質は、神経線維およびグリア細胞などの神経堤に由来する細胞において発現され、これは、しばしば、HD 罹患セグメント6の粘膜下組織における神経肥大を示す。タンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) は、神経線維および神経節細胞を確実に染色する。PGP 9.5 染色は、特に孤立した hypoganglionosis の場合、calretinin 染色の補足として機能します。S100 および PGP 9.5 との二重染色は、偽陰性率を減少させ、感度を高めることができます。前提条件として、現在の研究は、この新規診断方法の十分な特異性および高感度を確保することを目的とする。私たちの新しいプロトコルは、aganglionic 腸と肥厚性神経線維の識別のために3つのマーカーすべてを使用しました。318子供の将来の研究は、私たちの研究室によって行われ、以前に詳細なプロトコル7なしで公開しました。詳細なプロトコルと注意事項については、この記事で説明します。出生後に重度の排便問題を患った新生児、または他の一般的な疾患を除く慢性便秘の小児は、直腸吸引生検 (RSB) の候補となる可能性がある。私達の新しい議定書は RSBs だけでなく、最終的な診断を作るために完全な厚さのバイオプシーまたは外科標本を染色のために適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、HD の診断のために RBS セクションを染色する3つの異なる免疫組織化抗体を用いた手順について説明した。診断プロトコールの感度は 96.49% (95% CI, 0.88-0.99) であり, 特異性は 100% であった (95% CI, 0.97-1.00)。
プロトコルの最も重要なステップは、RSB および抗原抗体反応である。生検のサイズは、染色の精度を決定する。小さな生検は、正確な診断を下すために十分?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、撮影室を提供することに彼の大きな助けを Weibing タンに感謝します。この記事は公的福祉研究によって支えられており、中国の国民健康・家族計画 (グラント 201402007) から特別資金が寄せられました。
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
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