Диагностика болезни Гиршпрунга путем иммуноокрашивания ректальное всасывание биопсии для Calretinin, S100 белка и белка гена продукта 9,5
Summary
Этот протокол описывает процесс иммуноокрашивания ректального всасывания биопсии для calretinin, белок S100, и гена белка продукта 9,5. Этот роман адъювантной диагностический метод для болезни Гиршпрунга имеет предпочтительнее чувствительность и специфичность ставок.
Abstract
Гиршпрунга болезнь (HD) является врожденным кишечным заболеванием, которое клинически проявляется как неспособность пройти мекония у младенцев или как долгосрочный Запор у детей. Ректальное всасывание биопсии (RSB), чтобы определить отсутствие ганглиозных клеток и нейронная гипертрофия является наиболее точным испытанием для диагностики HD в настоящее время. Традиционный гематоксифлин-ээин окрашивание не имеет чувствительности и специфичности. Окрашивание ацетилхолинэстеразы не может быть широко использовано из-за его сложного процесса. Наш Роман протокол иммуноокрашивания для calretinin, белок S100, и белок гена продукта 9,5 (PGP 9,5), который мы провели на РСБС, экспонаты высокой чувствительности и специфичности ставки 96,49% (95% доверительный интервал, 0.88-0.99) и 100% (95% доверия интервал, 0.97-в), соответственно. В HD-пострадавших сегментов часто присутствуют как отсутствие экспрессии calretinin, белок S100, и PGP 9,5, которые являются маркерами нейронной гипертрофии в субслизистой ткани. Этот протокол описывает подробный операционный процесс этого нового диагностического метода.
Introduction
Гиршпрунга болезнь (HD) является распространенным врожденным кишечным расстройством кишечника характеризуется отсутствием ганглиозных клеток в различных сегментах дистальной желудочно-кишечного тракта1. Нервной системы человека кишечной формируется, когда вторжение в эмбриональных нервных клеток завершена. Если есть нарушение процесса и вторжение не удается завершить, дистальной кишечник новорожденного становится аангликаноническим2. Это потенциально смертельное состояние называется болезнью Гиршпрунга. Пролиферация, подвижность, и рост кишки три основных компонента успешной колонизации.
Традиционный гематоксифлин и ээин (H & E) окрашивание ограниченной субмукосной биопсии не может достигать удовлетворительного результата, так как окрашивание H & E полной толщины ткани, полученной от хирургии. Дополнительно, ацетилхолинэстеразы (боль) окрашивание ткани ректальной всасывающей является теоретически сложной задачей из-за его недостаточной чувствительности, которая составляет 91%, а сложная обработка замороженных разделов3,4. Несколько других иммуногинохимических маркеров ганглиозных клеток и нервных волокон, которые могут быть окрашены в формалин-фиксированной и парафин-встроенные образцы постепенно становится основной HD диагностики. Кальретиноин-это витамин D-зависимый кальций-связывающий белок, который не выражается в миокишечной и субслизистой сплетении HD-пораженные сегменты5. Белок S100 выражается в клетках, полученных от нейронных гребня, таких как нервные волокна и глиальных клеток, которые часто присутствуют нейронная гипертрофия в submucosal ткани HD-пострадавших сегментов6. Белок ген продукт 9,5 (PGP 9,5) надежно окрашивает нервные волокна и ганглиозных клеток; PGP 9,5 окрашивание выступает в качестве дополнения к кальретиноин окрашивание, особенно в случаях изолированных гипогантоз. Двойное окрашивание с S100 и PGP 9,5 может уменьшить ложноотрицательные скорости и увеличить чувствительность. В качестве предварительного условия, текущее исследование направлено на обеспечение адекватной специфичности и высокой чувствительностью этого романа диагностического метода. Наш Роман протокол использовал все три маркеры для дискриминации аглионинического кишечника и гипертрофических нервных волокон. Проспективное исследование 318 детей было выполнено нашей лабораторией и ранее Опубликовано без подробного протокола7. Подробный протокол и меры предосторожности обсуждаются в этой статье. Любые новорожденные, которые страдали от тяжелой дефекации с момента рождения или дети с хроническими запорами, исключая другие распространенные заболевания, являются потенциальными кандидатами для биопсии ректальной кишки (RSB). Наш Роман протокол подходит для окрашивания не только RSBs, но и полной толщины биопсии или хирургических образцов, чтобы сделать окончательный диагноз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали процедуру с использованием трех различных иммуногинахимических антител, чтобы испачкать секции РБС для диагностики БГ. Чувствительность нашего диагностического протокола составила 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), а специфика составила 100% (95% ДИ, 0.97-в).
Самыми критически…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Вэйбинг Танг за его большую помощь в обеспечении лаборатории съемок. Эта статья поддержана исследованием общественного благосостояния, и специальные фонды были получены от национального запланирования здоровья и семьи Кита (Грант No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
