Diagnóstico de doença de Hirschsprung por biopsias de sucção retal imunocoloração para Calretinina, proteína S100 e proteína gene produto 9,5
Summary
Este protocolo descreve o processo de biópsias rectal da sucção do immunomancha para o calretinin, a proteína S100, e o produto do gene da proteína 9,5. Este método diagnóstico adjuvante novo para Hirschsprung ‘ a doença de s tem taxas preferíveis da sensibilidade e da especificidade.
Abstract
Hirschsprung ‘ a doença de s (HD) é uma doença intestinal congenital que seja manifestada clìnica como uma inabilidade passar o mecônio nos infantes ou como a constipação a longo prazo nas crianças. A biópsia rectal da sucção (RSB) para determinar a ausência de pilhas do gânglio e a hipertrofia neural é o teste o mais exato para o diagnóstico de HD no presente. A coloração tradicional da hematoxilina-eosina carece de sensibilidade e especificidade. A coloração da acetilcolinesterase não pode ser amplamente utilizada devido ao seu processo complexo. Nosso novo protocolo de imunocoloração para calretinina, proteína S100 e produto de gene de proteína 9,5 (PGP 9.5), que realizamos no RSBs, apresenta altas taxas de sensibilidade e especificidade de 96,49% (intervalo de confiança de 95%, 0,88-0,99) e 100% (95% de confiança intervalo, 0,97-1,00), respectivamente. Os segmentos afetados pela DH frequentemente apresentam-se como ausência da expressão de calretinina, proteína S100 e PGP 9.5, que são marcadores de hipertrofia neural no tecido submucoso. Este protocolo descreve o processo operacional detalhado deste método diagnóstico novo.
Introduction
Hirschsprung ‘ a doença de s (HD) é uma desordem intestinal congenital comum do intestino caracterizada por uma falta de pilhas do gânglio em segmentos diferentes do intervalo intestinal longe do ponto de origem1. O sistema nervoso entérico humano é formado quando a invasão das células neurais embrionárias é completada. Se há uma perturbação do processo e a invasão não termina, o intestino distal do recém-nascido torna-se aganglionic2. Esta condição potencialmente fatal é chamada de doença de Hirschsprung. Proliferação, motilidade e crescimento intestinal são os três principais componentes da colonização bem-sucedida.
A coloração tradicional da hematoxilina e da eosina (H & E) de uma biópsia submucosal limitada não pode alcançar como satisfatório de um resultado como a mancha de H & E de um tecido da cheio-espessura obtido da cirurgia. Adicionalmente, a coloração da acetilcolinesterase (ache) do tecido de sucção retal é teoricamente desafiadora devido à sua sensibilidade inadequada, que é de 91%, e processamento complexo de seções congeladas3,4. Diversos outros marcadores immunohistochemical de pilhas do gânglio e de fibras de nervo que podem ser manchados em espécimes formalin-fixos e parafina-incorporados estão transformando-se gradualmente os diagnósticos mainstream de HD. A calretinina é uma proteína de ligação ao cálcio dependente da vitamina D que não é expressa no plexo mientérico e submucoso dos segmentos afetados pela DH5. A proteína S100 é expressa em células derivadas da crista neural, como fibras nervosas e células gliais, que muitas vezes apresentam hipertrofia neural no tecido submucoso de segmentos afetados pela DH6. O produto do gene da proteína 9,5 (PGP 9.5) mancha confiantemente fibras de nervo e pilhas do gânglio; A mancha de PGP 9.5 actua como um suplemento à mancha do calretinin, especial nos casos do hypoganglionosis isolado. A coloração dupla com S100 e PGP 9.5 pode diminuir a taxa falsa-negativa e aumentar a sensibilidade. Como pré-requisito, o presente estudo tem como objetivo garantir a especificidade adequada e a alta sensibilidade deste novo método de diagnóstico. Nosso protocolo novo usou todos os três marcadores para a discriminação do intestino aganglionic e das fibras de nervo hipertrófica. Um estudo prospectivo de 318 crianças foi realizado por nosso laboratório e previamente publicado sem um protocolo detalhado7. O protocolo detalhado e as precauções são discutidos neste artigo. Todos os neonatos que sofram de um problema severo da defecação desde o nascimento ou as crianças com constipação crônica que exclui outras doenças comuns são candidatos potenciais para a biópsia rectal da sucção (RSB). Nosso protocolo novo é apropriado para manchar não somente RSBs mas igualmente biópsias da cheio-espessura ou espécimes cirúrgicos para fazer um diagnóstico final.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um procedimento usando três anticorpos immunohistochemical diferentes para manchar seções de RBS para o diagnóstico de HD. A sensibilidade de nosso protocolo de diagnóstico foi de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), e a especificidade foi de 100% (95% IC, 0,97-1,00).
As etapas as mais críticas do protocolo são RSB e reação do antígeno-anticorpo. O tamanho da biópsia determina a exatidão da coloração. Uma biópsia pequena não fornecerá o suficiente tecido para faze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Weibing Tang por sua grande ajuda em fornecer o laboratório de filmagem. Este artigo é apoiado pela pesquisa do bem-estar público, e os fundos especiais foram recebidos do planeamento nacional da saúde e da família de China (Grant no. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
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