Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5

Published: April 26, 2019 doi: 10.3791/58799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pediatric Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Dit protocol beschrijft het proces van immunokleuring rectale zuig biopten voor calretinin, S100 proteïne, en proteïne gen product 9,5. Deze nieuwe adjuvante diagnostische methode voor de ziekte van Hirschsprung heeft de voorkeur gevoeligheid en specificiteit tarieven.

Abstract

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een aangeboren darmziekte die klinisch manifesteert zich als een onvermogen om meconium door te geven bij zuigelingen of als langdurige constipatie bij kinderen. Rectale zuig biopsie (RSB) om de afwezigheid van ganglioncellen en neurale hypertrofie te bepalen is de meest accurate test voor de diagnose van HD op dit moment. Traditionele hematoxyline-eosine kleuring ontbreekt gevoeligheid en specificiteit. Acetylcholinesterase kleuring kan niet op grote schaal worden gebruikt vanwege zijn complexe proces. Onze nieuwe protocol van immunokleuring voor calretinin, S100 Protein, en Protein Gene product 9,5 (PGP 9.5), die we uitgevoerd op RSBs, vertoont hoge gevoeligheid en specificiteit van 96,49% (95% betrouwbaarheidsinterval, 0.88-0.99) en 100% (95% vertrouwen interval, 0.97-1.00), respectievelijk. De HD-getroffen segmenten vaak aanwezig als de afwezigheid van de expressie van calretinin, S100 Protein, en PGP 9.5, die markers van neurale hypertrofie in de submucosale weefsel. Dit protocol beschrijft het gedetailleerde werkproces van deze nieuwe diagnostische methode.

Introduction

De ziekte van Hirschsprung (HD) is een gemeenschappelijke aangeboren darm darmaandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan ganglioncellen in verschillende segmenten van het distale darmkanaal1. De menselijke enterische zenuwstelsel wordt gevormd wanneer de invasie van de embryonale neurale cellen is voltooid. Als er een storing van het proces is en de invasie niet voltooit, wordt de distale darm van pasgeboren aganglionic2. Deze potentieel fatale aandoening heet de ziekte van Hirschsprung. Proliferatie, beweeglijkheid, en darm groei zijn de drie belangrijkste componenten van succesvolle kolonisatie.

Traditionele hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een beperkte submucosale biopsie kan niet bereiken als bevredigend van een resultaat als H & E kleuring van een full-dikte weefsel verkregen uit een operatie. Bovendien, acetylcholinesterase (pijn) kleuring van rectale zuig weefsel is theoretisch uitdagende vanwege de onvoldoende gevoeligheid, die is 91%, en complexe verwerking van bevroren secties3,4. Verschillende andere immunohistochemische markers van ganglioncellen en zenuwvezels die kunnen worden gekleurd in formaline-vaste en paraffine-embedded specimens zijn geleidelijk aan steeds de mainstream HD diagnostiek. Calretinin is een vitamine D-afhankelijke calcium-bindende eiwit dat niet wordt uitgedrukt in de myenteric en submucosale plexus van HD-getroffen segmenten5. S100 eiwit wordt uitgedrukt in cellen afgeleid van de neurale kuif, zoals zenuwvezels en glial cellen, die vaak aanwezig neurale hypertrofie in de submucosale weefsel van HD-getroffen segmenten6. Proteïne gen product 9,5 (PGP 9.5) betrouwbare vlekken zenuwvezels en ganglioncellen; PGP 9.5 kleuring fungeert als een aanvulling op calretinin kleuring, vooral in geval van geïsoleerde hypoganglionosis. De dubbele kleuring met S100 en PGP 9.5 kan het vals-negatieve tarief verminderen en de gevoeligheid verhogen. Als voorwaarde, de huidige studie is gericht op een adequate specificiteit en hoge gevoeligheid van deze nieuwe diagnostische methode te waarborgen. Onze nieuwe protocol gebruikt alle drie de markers voor de discriminatie van aganglionic darm en hypertrofische zenuwvezels. Een prospectieve studie van 318 kinderen werd uitgevoerd door ons lab en eerder gepubliceerd zonder een gedetailleerd protocol7. Het gedetailleerde protocol en de voorzorgsmaatregelen worden besproken in dit artikel. Elke pasgeborenen die leed aan een ernstige ontlasting probleem sinds de geboorte of kinderen met chronische constipatie met uitzondering van andere gemeenschappelijke ziekten zijn potentiële kandidaten voor rectale zuig biopsie (RSB). Onze nieuwe protocol is geschikt voor het bevlekken van niet alleen RSBs, maar ook full-dikte biopten of chirurgische specimens om een definitieve diagnose te stellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de onderzoek Ethiekraad van het ziekenhuis van de Unie van Huazhong Universiteit van wetenschap en technologie.

1. rectale zuig biopsie

  1. Voer de rectale zuig biopsie door een goed opgeleide pediatrische chirurg en een assistent met behulp van een Rbi2 zuig rectale biopsie systeem na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de voogd.
    1. Voer RSB op patiënten die de volgende indicaties hebben: onvermogen om meconium te passeren bij zuigelingen of langdurige opgeblazen gevoel met of zonder constipatie bij kinderen; kinderen met lange-termijn constipatie die behoefte hebben aan paraffineolie om de ontlasting te voltooien; intestinale obstructie of intestinale perforatie met onbekende redenen bij kinderen ondergaan een enterostomy.
      Opmerking: de contra-indicaties voor RSB zijn als volgt: kinderen die ernstige symptomen, die in slechte fysieke conditie, of die niet kunnen tolerant de RSB; kinderen met acute-stage enterocolitis; kinderen ondergaan intestinale anastomosis zonder volledige genezing.
  2. Voer een normale zoutoplossing retentie klysma als darm voorbereiding 36 h voor de procedure om losse ontlasting en overmatige oedeem van het slijmvlies te voorkomen. Voeg magnesiumsulfaat oplossing als het kind heeft ernstige constipatie. Toediening van vitamine K (1 mg/kg) aan pasgeborenen.
    Opmerking: Voer geen preoperatieve bloedtesten of het beheer van antibiotica, omdat ze niet nodig zijn.
  3. Zet de patiënt in de lithotomy positie. Bedek het oppervlak van de buis met paraffineolie. Plaats de stompe-end buis 4-7 cm in de endeldarm met de zijkant gat tegenover de achterste of laterale muren.
  4. Breng zachte druk op de buis om een adequate hechting van de zijkant gat te vergemakkelijken aan de rectale wand. Druk op de trigger en trek het gereedschap onmiddellijk in.
  5. Gebruik de biopsie-instrument om 4 zuig biopten te verkrijgen met een diameter van 2 mm op 3 cm en 6 cm boven de tand lijn, anteriorly en posteriorly. Gebruik een naald om het monster te plaatsen op een gaasje bevochtigd met een zoutoplossing.
  6. Observeer de patiënt tot 2 uur na de procedure uit te sluiten rectale bloeden. Vermijd verdere rectale en anale manipulaties in de eerste 24 uur na RSB.

2. voorbereiding van de RSB secties

  1. Plaats de rectale zuig biopten in 4% Paraformaldehyde voor 6 uur om het weefsel vast te stellen. Gebruik een fixatief volume 5 keer meer dan het weefsel volume.
  2. Dehydrateer het weefsel met behulp van de pathologische weefsel dehydrater voor 11 h. Het hele geprogrammeerde proces bestaat uit de volgende 5 stappen:
    1. Plaats het weefsel in formaldehyde en bevestig voor 1 uur.
    2. Plaats het weefsel in 75% ethanol voor 4 uur.
    3. Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 1 h elk).
    4. Plaats het weefsel in absolute ethanol (twee veranderingen, 30 min elk).
    5. Plaats het weefsel in xyleen (drie veranderingen, 1 h elk).
  3. Plaats het weefsel in paraffine (58-60 °C) (drie veranderingen, 1 h elk). Embed de RSB weefsels in paraffineblokken.
  4. Trim de paraffineblokken met behulp van een microtome totdat het weefsel volledig is blootgesteld met een complete sectie vliegtuig.
  5. Snijd de blokken in 0,4 μm secties met een microtome.
  6. Plaats de secties in 45-50 °C water voor een paar seconden elk om de secties toe te laten om in een vlakke plaat te verspreiden.
  7. Breng de paraffine secties over op dia's.
  8. Bak de dia's in een 60 °C oven voor 3-5 h. Vermijd bakken te lang, wat kan leiden tot het verlies van de antigenen.
  9. Plaats de ontparaffine dia's in xyleen (2 veranderingen, 15 min elk).
  10. Hydrateren de dia's in absolute ethanol, 95%, 80%, en 75% ethanol voor 5 min elk. Vervolgens spoel ze in omgekeerde osmose (RO)-gezuiverd water voor nog eens 5 minuten.

3. het herwinning van het antigeen

  1. Maakwerk verdunningen voor calretinin ophalen door het mengen van 4 mL EDTA-antigeen ophalen buffer met 200 mL van RO-gezuiverd water. Maakwerk verdunningen voor S100 en PGP 9.5 ophalen door het mengen van 1 mL citroenzuur natrium citraat buffer (100x) met 99 mL van RO-gezuiverd water.
    Opmerking: Calretinin kan bij voorkeur worden opgehaald door EDTA-oplossing voor het ophalen. Echter, citroenzuur natrium citraat buffer is meer geschikt voor het ophalen van S100 en PGP 9.5.
  2. Plaats de dia's in een coplin kleuring jar. Vul de pot met ophalen oplossing en plaats deze in een voorverwarmd kokend waterbad. Na het koken voor 20 min, verwijder de pot uit het waterbad en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Het koelproces duurt ongeveer 10 minuten. Verwijder de dia's en spoel ze voorzichtig af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Teken een cirkel met een marker pen rond het weefsel en voor te bereiden een natte doos voor de volgende procedures.

4. blokkeren

  1. Maakwerk verdunningen door 3 mL 30% H2O2 te mengen met 27 ml ro-gezuiverd water.
  2. Voeg twee of drie druppels van 3% H2O2 oplossing dropwise op het weefsel te blokkeren peroxidates. Voeg de H2O2 oplossing onmiddellijk toe om ervoor te zorgen dat de oplossing niet van de cirkel overloopt. Voer blokkering van peroxidates uit in een incubator van 37 °C voor 20 min.
  3. Spoel de dia's voorzichtig met PBS (drie wasbeurten, 5 min elk).
  4. Blokkeer de dia's voor 20 min bij 37 °C met 5% boviene serum albumine (BSA, bereid door het mengen van 1,5 g van BSA poeder met 30 mL RO-gezuiverd water).
    Opmerking: blokkeren met 3% H2O2 kan voorkomen dat 95% van de niet-specifieke kleuring en blokkering met 5% BSA kan voorkomen dat de andere 5% van de niet-specifieke kleuring. Combineer de twee methoden om een betrouwbaar resultaat te verkrijgen.

5. antigeen-antilichaam reactie

  1. Verwijder de 5% BSA en voeg 50 l van primair antilichaam (calretinin, S100, of PGP 9.5) toe aan de dia. Incubeer overnachting bij 4 °C.
  2. Was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).
  3. Voeg 50 l van de polymeer versterker toe (reagens A; Zie de lijst van materialen) aan de sectie en Incubeer het 20 min in een incubator van 37 °c. Dan, was de dia met PBS (drie keer, 3 min elk).
  4. Voeg 50 l van secundair antilichaam B (geit anti-konijn/muis IgG secundair antilichaam) aan de sectie toe en incubeer 30 min in een incubator van 37 °C. Was de sectie met PBS (drie keer, 5 min elk).

6.3, 3-Diaminobenzidine en hematoxyline kleuring

  1. Voeg 850 l van RO-gezuiverd water toe aan een buis van 1,5 mL en voeg de kleurstoffen reagentia toe (Zie de materiaallijst) in de volgorde a; B, en C. Voeg 50 l van elk reagens toe om een totaal van 1 ml 3, 3-DIAMINOBENZIDINE (DAB) werkoplossing te verkrijgen. Als er precipitaten, gebruik de oplossing na filtratie.
  2. Voeg een druppel van DAB werkende oplossing om het weefsel sectie en vlek voor 3-10 min. Incubeer de dia's in schar bij kamertemperatuur tot bruine kleuring wordt gedetecteerd. Monitor zorgvuldig met behulp van een helderveld Microscoop. Houd de DAB-werkoplossing weg van het licht. Dan, was de dia met PBS 5 min.
  3. Voeg een druppel hematoxyline aan eosine de kernen voor ongeveer 1 min. Dan, houd de coplin pot en was het onder een straaltje water voor ongeveer 30-40 s tot de overtollige kleurstof wordt verwijderd. Zorg ervoor dat u de weefselsecties niet beschadigt.
  4. Dompel de RSB dia's in een coplin jar met PBS voor 25-30 s. Dan, onderscheid in 1% hydrochloric zuur-ethylalcohol voor 10 s. was de dia's met PBS 1 min.
  5. Dehydrateer de dia's in de omgekeerde volgorde van hydratatie: 75%, 80%, 95%, en absolute ethanol (5 min elk).
  6. De dia's blootstellen aan xyleen (2 veranderingen, 5 min elk).
  7. Monteer de dekglaasje met ultraclean montage. Laat dia's drogen voordat visualisatie met behulp van een microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In totaal werden 318 patiënten ingeschreven in onze studie. Alle patiënten onderging RSB, en de weefsels werden gekleurd voor calretinin, S100, en PGP 9.5. De diagnose op basis van onze nieuwe protocol was HD in 97 gevallen, niet-HD in 213 gevallen, en vermoed HD in 8 gevallen. Onder de 132 chirurgische patiënten, 99 patiënten werden gediagnosticeerd met HD door immunokleuring van volledige dikte specimens na de operatie. S100 en PGP 9.5 kleuring bleek dat 92% en 93% van de 99 patiënten, respectievelijk, had hypertrofisch zenuw stammen. De andere 83 van de 186 patiënten onderging Full-dikte biopten en toonde ganglioncellen. Een totaal van 103 patiënten werden klinisch genezen door conservatieve therapieën, en HD werd uitgesloten. Van de 8 patiënten met verdachte HD, 3 patiënten werden gecategoriseerd als korte-segment HD, en de andere 5 patiënten werden gecategoriseerd als niet-HD.

Volgens onze resultaten, 97 patiënten werden gediagnosticeerd door RSB aanvankelijk. Gedetailleerde informatie wordt weergegeven in tabel 1. Het Protocol van immunohistochemische kleuring voor calretinin, S100 en PGP 9.5, die we uitgevoerd op RSBs, heeft een hoge gevoeligheid en specificiteit van 96,49% (95% betrouwbaarheidsinterval [CI], 0.88-0.99) en 100% (95% CI, 0.97-1.00), respectievelijk. De positieve voorspellende waarde is 94,3% (95% CI, 0.87-0.99), en de negatieve voorspellende waarde is 99,1% (95% CI, 0.95-1.00).

Figuur 1a en 1B vertegenwoordigen typische resultaten na immunokleuring voor calretinin. Vele ganglioncellen, die calretinin uitdrukken, kunnen in de normale weefsels worden gevonden. Echter, geen ganglioncellen werden gedetecteerd in elk gebied van het weefsel van de HD-segment. Zoals weergegeven in figuur 1c-F, S100 en PGP 9.5 immunokleuring toont hypertrofisch zenuw stammen in de submucosa, terwijl alleen granulaire kleuring van enkele kleine zenuw twijgen werd waargenomen in de normaal geïnnerveerd darm. In onze studie, hypertrofische zenuw stammen zijn zenuwvezels met een diameter van ≥ 40 μm.

Figure 1
Figuur 1: immunokleuring van rectale zuig biopten voor calretinin, PGP 9.5, en S100. Immunokleuring voor calretinin in HD-aangetast weefsel (a) en in ganglioncellen van myenteric plexuses in normaal geïnnerveerd weefsel (B). Geen calretinin kleuring werd gedetecteerd in de myenteric plexuses van de HD-getroffen segment. PGP 9.5 kleuring in HD-aangetast weefsel toonde dichte hypertrofische zenuwvezels in de submucosa (C) in tegenstelling tot zenuwvezels in de normale weefsels (D). (E) dichte en prominente S100 immunokleuring toonde hypertrofische zenuw stammen in de submucosa van HD-aangetast weefsel. (F) normale zenuwvezels in de submucosa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

eiwit markeringen HD (99) Niet-HD (219)
ganglioncellen (+) Hypertrofische zenuw stammen (+) ganglioncellen (+) Hypertrofische zenuw stammen (+)
calretinin 2 — 214 —
S100 — 91 — 3
PGP 9.5 — 92 — 4

Tabel 1: immunohistochemische kleuring scores voor de drie eiwit markeringen in rectale zuig biopten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier hebben we beschreven een procedure met behulp van drie verschillende immunohistochemische antistoffen aan RBS secties vlek voor de diagnose van HD. De gevoeligheid van ons diagnostisch protocol was 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), en de specificiteit was 100% (95% CI, 0.97-1.00).

De meest kritieke stappen van het protocol zijn RSB en antigeen-antilichaam reactie. De grootte van de biopsie bepaalt de nauwkeurigheid van de kleuring. Een kleine biopsie zal niet genoeg weefsel om een precieze diagnose te maken, terwijl een grote biopsie leidt tot een hoger risico op bloeden. Als een kwestie van ervaring, biopten met een diameter van 2 mm zijn de optimale grootte. Voor de antigeen-antilichaam reactie, kan het juiste behoud van het antilichaam worden genegeerd niet. Na het protocol stap voor stap en zachtjes werken zijn nodig. Omgekeerde osmose-gezuiverd water wordt aanbevolen in alle stappen, waardoor een duidelijker gebied voor observatie en het gemakkelijker maken voor patholoog om een nauwkeurige diagnose te stellen.

Contrast klysma, anorectale manometrie, en biopsie met histologie zijn drie preoperatieve diagnostische methoden die zijn gebruikt in de afgelopen jaren. Volgens Tony et al.' s onderzoek, biopsie met histologie heeft de hoogste gevoeligheid en specificiteit8. Meier-Ruge et al. eerste gemeld het gebruik van acetylcholinesterase (pijn) kleuring op bevroren rectale aanzuig weefsel te helpen diagnosticeren HD in 19729. Deze kleuring methode detecteert hypertrofische zenuw stammen in de submucosa. Na dat rapport, begonnen vele instellingen rond de wereld deze methode als toevoegsel voor de diagnose van HD te gebruiken. vanwege de diagnostische beperkingen, onderzoekers begonnen zich te concentreren op andere markers die ook kunnen vlekken op de ganglioncellen en zenuwvezels in formaline-vaste en paraffine-ingebedde specimens. In 2004, Barshack et al. gevonden dat het verlies van calretinin expressie kan helpen diagnosticeren aganglionic segmenten in HD10. Kapur et al. en Guinard-Samuel et al. herhaalde het protocol in 2009 en concludeerde dat immunohistochemische kleuring voor calretinin superieur was aan vlekken voor acetylcholinesterase11,12. In 1988, S100 immunokleuring voor de diagnose van HD werd voor het eerst geïntroduceerd door Robey et al. 13. Monforte-Muñoz et al. herhaalde de methode in 1998 en vond dat 90% van hun 20 Hirschsprung gevallen zenuwvezels breder dan 40 μm14hadden. Daarom kan S100 immunokleuring dienen als een ondersteunende diagnostische methode in gevallen zonder ganglioncellen. Bovendien, Bachmann et al. merkte op dat immunohistochemische kleuring voor Map2, CALRETININ, GLUT1, en S100 een betrouwbaar resultaat kon verkrijgen zo nauwkeurig zoals bevroren sectie technieken15. Echter, in 1992, Sams et al. evalueerde de waarde van PGP 9.5 in de diagnose van HD16. Hoewel S100 kan detecteren meer dunne propria zenuwvezels, het heeft een hogere vals-negatieve tarief. Daarom kozen we ervoor om PGP 9.5 en S100 samen te gebruiken voor de immunohistochemische diagnose van HD, zoals eerder aanbevolen studies. Veel gevallen van kleuring voor neuron-specifieke Enolase in overgangszones toonde ook positieve ganglioncellen in de myenteric en submucosale plexus, maar deze cellen waren schaars en kleine12. Evenzo, calretinin-positieve ganglioncellen zijn klein en hebben een geclusterde formatie. Een vorige studie wees uit dat sommige lichtjes dik gemaakte zenuw stammen ook in de overgangs segmenten van HD konden worden ontdekt, maar met totale Colon aganglionosis, kunnen de zenuw boomstams binnen normale grenzen (< 40 μm)17zijn. We moeten analyseren de resultaten geval per geval en combineren deze resultaten met klinische manifestaties om een verkeerde diagnose te voorkomen.

Dit protocol kon niet de definitieve pathologische diagnose vertegenwoordigen, zodat voerden wij een minimum van één jaar van grondige klinische follow-up voor elk kind uit. Bovendien, dit protocol vereist meer monsters om de betrouwbaarheid te bewijzen.

Samenvattend, is de diagnose van HD door RSB een geschikte methode die een ideale histologische diagnose met aanvaardbare minimale verwonding verstrekt. De gevoeligheid is nauw verwant aan de vraag of de plaats van bemonstering juist is. Immunohistochemische kleuring van RSB voor calretinin, S100, en PGP 9.5 is gevoelig en specifiek in de opsporing van ganglioncellen en hypertrofische zenuw stammen. De combinatie van deze drie markers biedt een meer betrouwbare diagnostische methode voor HD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Weibing Tang voor zijn grote hulp bij het verstrekken van de filmen Lab. Dit artikel wordt gesteund door het openbare welzijns onderzoek, en de speciale fondsen werden ontvangen van de nationale gezondheid en de familie planning van China (toelage nr. 201402007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
calretinin antibody MXB Biotechnologies MAB-0716 170416405c antibody: primary antibody
S-100 antibody MXB Biotechnologies Kit-0007 antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody Shanghai long island antibody Co. Ltd R-0457-03 antibody: primary antibody
enhancer reagent MXB Biotechnologies KIT-9902-A 170416405a antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody MXB Biotechnologies KIT-9902-B antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C) MXB Biotechnologies DAB-0031 staining kit
Heat incubator Shanghai yiheng instrument Co. Ltd DHP-9082 instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia CP1200 HP1000 SS1000 instrument
microtome Leica leica RM2016 instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X) MXB Biotechnologies MVS-0101 antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator wuhan junjie electronic Co. Ltd JT-12F instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
  2. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
  3. Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
  4. Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
  5. Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
  6. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  7. Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
  8. Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
  9. Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
  10. Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
  11. Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
  12. Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
  13. Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
  14. Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
  15. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  16. Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
  17. Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 146 de ziekte van Hirschsprung rectale zuig biopsie calretinin S100 proteïne proteïne gen product 9,5 immunokleuring
Diagnose van de ziekte van Hirschsprung door immunokleuring rectale zuig biopten voor Calretinin, S100 proteïne en eiwit gen product 9,5
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chi, S., Fang, M., Li, K., Yang, L., … More

Chi, S., Fang, M., Li, K., Yang, L., Tang, S. t. Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5. J. Vis. Exp. (146), e58799, doi:10.3791/58799 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter