Diagnos av Hirschsprungs sjukdom genom Immuninfärgning rektal sug biopsier för Calretinin, S100 protein och protein Gene produkt 9,5
Summary
Detta protokoll beskriver processen för immunofärgning rektal sug biopsier för calretinin, S100 protein, och protein gen produkt 9,5. Denna roman adjuvant diagnostisk metod för Hirschsprungs sjukdom har att föredra känslighet och specificitet priser.
Abstract
Hirschsprungs sjukdom (HD) är en medfödd tarm sjukdom som är kliniskt manifesterad som en oförmåga att passera Mekonium hos spädbarn eller som långtids förstoppning hos barn. Rektalsugbiopsi (RSB) för att bestämma frånvaron av ganglionceller och neurala hypertrofi är det mest exakta testet för diagnos av HS för närvarande. Traditionell hematoxylin-eosin färgning saknar känslighet och specificitet. Acetylkolinesteras färgning kan inte användas i stor utsträckning på grund av dess komplexa process. Vårt nya protokoll immuninfärgning för calretinin, S100 protein och protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5), som vi genomförde på RSBs, uppvisar hög känslighet och specificitet på 96,49% (95% KONFIDENS intervall, 0,88-0,99) och 100% (95% konfidensgrad intervallet, 0,97-1,00). De HD-drabbade segmenten förekommer ofta som frånvaron av uttrycket av calretinin, S100 protein, och PGP 9.5, som är markörer för neurala hypertrofi i submukosala vävnad. Detta protokoll beskriver den detaljerade processen för denna nya diagnostiska metod.
Introduction
Hirschsprungs sjukdom (HD) är en vanlig medfödd tarm sjukdom som kännetecknas av brist på ganglionceller i olika segment av den distala tarm kanalen1. Det mänskliga enteriska nerv systemet bildas när invasionen av embryonala neurala celler är avslutad. Om det finns en störning av processen och invasionen Miss lyckas med att slutföra, den distala tarmen av nyfödda blir aganglionic2. Detta potentiellt dödliga tillstånd kallas Hirschsprungs sjukdom. Proliferation, motilitet, och gut tillväxt är de tre huvud komponenterna i framgångs rik kolonisering.
Traditionell hematoxylin och eosin (H & E) färgning av en begränsad submukosala biopsi kan inte uppnå så tillfredsställande av ett resultat som H & E färgning av en full-tjocklek vävnad som erhållits från kirurgi. Dessutom, acetylkolinesteras (värk) färgning av rektal sugvävnad är teoretiskt utmanande på grund av dess otillräckliga känslighet, som är 91%, och komplex bearbetning av frysta avsnitt3,4. Flera andra immunhistokemiska markörer av ganglionceller och nerv fibrer som kan färgas i Formalinfixerade och paraffin-inbäddade preparat blir successivt mainstream HD-diagnostik. Calretinin är ett vitamin D-beroende kalcium-bindande protein som inte uttrycks i myenteric och submukosala plexus av HS-drabbade segment5. S100 protein uttrycks i celler som härrör från neurala Crest, såsom nerv fibrer och gliaceller, som ofta närvarande neurala hypertrofi i submukosala vävnad av HS-drabbade segment6. Protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5) fläckar tillförlitligt nerv fibrer och ganglionceller; PGP 9.5 färgning fungerar som ett komplement till calretinin färgning, särskilt i fall av isolerad hypoganglionosis. Dubbel färgning med S100 och PGP 9.5 kan minska den falskt negativa hastigheten och öka känsligheten. Som en förutsättning, den aktuella studien syftar till att säkerställa adekvat specificitet och hög känslighet för denna nya diagnostiska metod. Vårt nya protokoll använde alla tre markörer för diskriminering av aganglionic tarm och hypertrofiska nerv fibrer. En prospektiv studie av 318 barn utfördes av vårt labb och tidigare publicerats utan ett detaljerat protokoll7. Det detaljerade protokollet och försiktighets åtgärderna diskuteras i den här artikeln. Alla nyfödda som drabbats av ett allvarligt defekation problem sedan födseln eller barn med kronisk förstoppning exklusive andra vanliga sjukdomar är potentiella kandidater för rektal sugbiopsi (RSB). Vårt nya protokoll lämpar sig för färgning inte bara RSBs utan även full-tjocklek biopsier eller kirurgiska prover för att göra en slutlig diagnos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrev vi ett förfarande med tre olika immunhistokemiska anti kroppar för att färga RBS-sektioner för diagnos av HS. Känsligheten hos vårt diagnostiska protokoll var 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), och specificiteten var 100% (95% CI, 0,97-1.00).
De mest kritiska stegen i protokollet är RSB och antigen-antikroppsreaktion. Storleken på biopsi bestämmer noggrannheten av färgning. En liten biopsi kommer inte att ge tillräckligt med vävnad för att göra en exakt diagnos, medan en st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Weibing Tang för hans stora hjälp att tillhandahålla inspelningen labbet. Denna artikel stöds av Public välfärd Research, och särskilda medel mottogs från den nationella hälso-och familje planering i Kina (Grant No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
