Summary

Diagnose der Hirschsprung-Krankheit durch die Immunofelflecken-Rectal Suction Biopsien für Calretinin, S100 Protein und Protein Gene Produkt 9.5

Published: April 26, 2019
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Immunfärbung von rektalen Absaugbiopsien für Calretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5. Diese neuartige Adjuvan-Diagnostik für Hirschsprungs Krankheit hat bevorzugt Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten.

Abstract

Hirschsprungs Krankheit (HD) ist eine angeborene Darmerkrankung, die sich klinisch als Unfähigkeit manifestiert, Mekonium bei Säuglingen oder als langfristige Verstopfung bei Kindern zu passieren. Die Rectal-Saugbiopsie (RSB) zur Bestimmung des Fehlens von Ganglienzellen und der neuronalen Hypertrophie ist derzeit der genaueste Test für die Diagnose von HD. Der traditionellen Hämatoxlin-Eosin-Färbung fehlt es an Sensibilität und Spezifität. Die Acetylcholinesterase-Färbung kann aufgrund ihres komplexen Prozesses nicht weit verbreitet sein. Unser neuartiges Protokoll der Immunfärbung für Kalretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), das wir an RSBs durchgeführt haben, weist hohe Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall, 0,88-0,99) und 100% (95% Zuversicht auf Intervall, 0,97-1.00), bzw. Die HD-betroffenen Segmente treten oft als das Fehlen des Ausdrucks von Calretin, S100-Protein und PGP9.5 auf, die Marker der neuronalen Hypertrophie im submukosmischen Gewebe sind. Dieses Protokoll beschreibt den detaillierten Arbeitsprozess dieser neuen Diagnosemethode.

Introduction

Hirschsprungs Erkrankung (HD) ist eine häufige angeborene Darmdarmstörung, die durch einen Mangel an Ganglienzellen in verschiedenen Segmenten des distalenDarms 1 gekennzeichnet ist. Das menschliche, enterische Nervensystem entsteht, wenn die Invasion der embryonalen Zellen abgeschlossen ist. Wenn es eine Störung des Prozesses gibt und die Invasion nicht abgeschlossen ist, wird der Distanzdarm des Neugeborenen aganglionisch2. Dieser potenziell tödliche Zustand wird Hirschsprungs Krankheit genannt. Verbreitung, Beweglichkeit und Darmwachstum sind die drei Hauptbestandteile einer erfolgreichen Kolonisierung.

Die traditionelle Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann eine begrenzte submukosmale Biopsie nicht so zufriedenstellend erreichen wie die H-& E-Färbung eines aus der Operation gewonnenen Volldickengewebes. Darüber hinaus ist die Acetylcholinesterase (AChE) Färbung des rektalen Sauggewebes theoretisch eine Herausforderung, da die Empfindlichkeit von 91% nicht ausreichend ist, unddie komplexe Verarbeitung der gefrorenen Abschnitte3,4. Mehrere andere immunhistochemische Marker von Ganglienzellen und Nervenfasern, die in formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Proben verfärbt werden können, werden nach und nach zur Mainstream-HD-Diagnostik. Calretinin ist ein Vitamin D-abhängiges Kalziumbindenprotein, das sich nicht im myenterischen und submukosmischen Plexus von HD-betroffenenSegmenten 5 ausdrückt. S100-Protein wird in Zellen ausgedrückt, die aus dem neuronalen Kamm abgeleitet werden, wie Nervenfasern und Gliazellen, die im Submukosmonalgewebe der HD-betroffenenSegmente 6 oft neuronale Hypertrophie aufweisen. Protein-Gen-Produkt 9.5 (PGP9.5) verfärbt zuverlässig Nervenfasern und Ganglienzellen; Die PGP9.5-Färbung dient als Ergänzung zur Kalretinin-Färbung, insbesondere bei isolierter Hypoganglionose. Doppelfärbung mit S100 und PGP9.5 kann die Falsch-Negativrate senken und die Empfindlichkeit erhöhen. Als Voraussetzung ist, dass die aktuelle Studie eine ausreichende Spezifität und hohe Empfindlichkeit dieser neuartigen Diagnostik gewährleisten soll. Unser neuartiges Protokoll verwendete alle drei Marker für die Diskriminierung von aganglionischen Darm und hypertrophen Nervenfasern. Eine prospektive Studie mit 318 Kindern wurde von unserem Labor durchgeführt und zuvor ohne ein detailliertes Protokoll7veröffentlicht. Das detaillierte Protokoll und die Vorsichtsmaßnahmen werden in diesem Artikel diskutiert. Alle Neugeborenen, die seit der Geburt an einem schweren Defekationsproblem litten, oder Kinder mit chronischer Verstopfung, die andere Volkskrankheiten ausgrenzend ausgrenzten, sind potenzielle Kandidaten für die rektale Saugbiopsie (RSB). Unser neuartiges Protokoll eignet sich zur Färbung nicht nur von RSBs, sondern auch zur Färbung von Biopsien oder chirurgischen Proben, um eine endgültige Diagnose zu stellen.

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom Research Ethics Board des Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology genehmigt. 1. Rectal Suction Biopsie Führen Sie die rektale Saugbiopsie durch einen gut ausgebildeten Kinderchirurgen und einen Assistenten mit einem Rbi2-Saugbiopsiesystem durch, nachdem Sie vom Vormund eine informierte Einwilligung erhalten haben. RSB bei Patienten durchführen, die folgende Indikationen haben: Unfähigkeit, Mekonium bei Säuglingen zu passi…

Representative Results

Insgesamt waren 318 Patienten in unsere Studie aufgenommen worden. Alle Patienten unterliefen RSB, und das Gewebe wurde für Calretinin, S100 und PGP9.5 gefärbt. Die Diagnose, die auf unserem neuartigen Protokoll basiert, war HD in 97 Fällen, Nicht-HD in 213 Fällen und Verdacht HD in 8 Fällen. Unter den 132 chirurgischen Patienten wurden 99 Patienten nach der Operation durch Immunfärbung von Volldickenproben mit HD diagnostiziert. Die Färbung der S100 und PGP9.5 zeigte, dass 92% bzw…

Discussion

Hier beschrieben wir ein Verfahren mit drei verschiedenen immunhistochemischen Antikörpern, um RBS-Abschnitte für die Diagnose von HD zu verfärben. Die Empfindlichkeit unseres Diagnoseprotokolls betrug 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), und die Spezifität lag bei 100% (95% CI, 0,97-1,00).

Die kritischsten Schritte des Protokolls sind die RSB-und Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Größe der Biopsie bestimmt die Genauigkeit der Färbung. Eine kleine Biopsie liefert nicht genügend Gewebe, um eine …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Weibing Tang für seine große Hilfe bei der Bereitstellung des Drehortes. Dieser Artikel wird von der Public Welfare Research unterstützt, und Sonderfonds wurden von der National Health and Family Planning of China (Grant No.201402007) erhalten.

Materials

calretinin antibody MXB Biotechnologies MAB-0716 170416405c antibody: primary antibody
S-100 antibody MXB Biotechnologies Kit-0007 antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody Shanghai long island antibody Co. Ltd R-0457-03 antibody: primary antibody
enhancer reagent MXB Biotechnologies KIT-9902-A 170416405a antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody MXB Biotechnologies KIT-9902-B antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C) MXB Biotechnologies DAB-0031 staining kit
Heat incubator Shanghai yiheng instrument Co. Ltd DHP-9082 instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia CP1200 HP1000 SS1000 instrument
microtome Leica leica RM2016 instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X) MXB Biotechnologies MVS-0101 antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator wuhan junjie electronic Co. Ltd JT-12F instrument

References

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Cite This Article
Chi, S., Fang, M., Li, K., Yang, L., Tang, S. Diagnosis of Hirschsprung’s Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5. J. Vis. Exp. (146), e58799, doi:10.3791/58799 (2019).

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