استغلال التصوير الحي إلى نويات المسار خلال ميوبلاست التمايز والانصهار
Summary
الهيكل العظمى والعضلات والتفريق هو عملية ديناميكية للغاية، التي تعتمد خاصة على المواقع النووية. وهنا يصف لنا طريقة لتعقب تحركات الأنوية بتصوير الخلية الحية أثناء تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست والقيام بوصف كمي لديناميات الأنوية باستخراج المعلومات من التعقب التلقائي.
Abstract
المواقع النووية داخل الخلايا مهم للعمليات الخلوية متعددة في مجال التنمية والتجدد. المثال الأكثر إثارة للاهتمام لتحديد المواقع النووية يحدث أثناء تمايز الهيكل العظمى والعضلات. ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي شكلتها انصهار خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتفرقة. المواقع النووية الصحيح داخل ميوفيبيرس مطلوب من أجل تجديد العضلات السليمة والدالة. إجراءات مشتركة لتقييم تشكيل التمايز وميوفيبير ميوبلاست يعتمد على الخلايا الثابتة تحليلها بواسطة الفلورة، مما يعوق دراسة سلوك الحركة وخلية نووية على مر الزمن. هنا، نحن تصف أسلوباً لتحليل تشكيل التمايز وميوفيبير وميوبلاست بتصوير الخلايا الحية. نحن نقدم برنامج لتعقب النووي الآلي للحصول على وصف كمي الفائق ديناميات النووية والسلوك ميوبلاست (أي المسار) خلال التمايز والانصهار.
Introduction
الهيكل العظمى والعضلات من الأنسجة أكبر في الجسم البشري، وبلغ مجموعها 35-40 ٪ من كتلة الجسم1. الخلايا الأقمار الصناعية هي الخلايا الجذعية العضلية، تشريحيا تتميز بموقفهم (محاذياً لغشاء البلازما، تحت الصفيحة القاعدية لألياف العضلات)، التي تؤدي إلى تكاثر myoblasts (الخلايا السلف شذوذ)، وفي نهاية المطاف يفرق ودمج ميوفيبيرس القائمة و/أو الصمامات بشكل جديد ميوفيبيرس2،،من34. اكتشافهم والتقدم المحرز في دراسة تلك الأحياء أدى إلى أفكاراً هامة في تنمية العضلات والتجدد.
بروتوكولات لعزل وتفرق ميوبلاستس في ميوتوبيس قد وضعت منذ سنوات عديدة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيكل العظمى والعضلات التمايز5،،من67. بيد أن معظم هذه الطرق تمثل الإجراءات الثابتة التي تعتمد على تحليل الخلايا الثابتة، ونتيجة لذلك، عدم السماح للعلماء بالكامل استكشاف عمليات ديناميكية للغاية، مثل ميوبلاست الانصهار والنضج ميوفيبير. المثال الأكثر إثارة للدهشة هو تحديد المواقع النووية، التي محكم التنظيم، مع الأنوية في البداية في مركز ميوفيبير، وثم، تقع في المحيط بعد نضوج ميوفيبير8،9. تصوير الحية هو الأسلوب الأكثر ملاءمة الحصول على المزيد من الأفكار في هذه ظاهرة غريبة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للعلماء لتسجيل تشكيل التمايز وميوتوبي ميوبلاست بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري وإجراء تحليلات كمية من التعقب التلقائي لنواة ميوبلاست. يوفر هذا الأسلوب الفائق وصف كمية للسلوك وديناميات وميوبلاست النووية خلال التمايز والانصهار. البروتوكول وينقسم إلى أربعة أجزاء مختلفة، وهي: (1) جمع عضلات من هيندليمبس الفئران، (2) عزل myoblasts الأولية التي تتكون في الهضم الميكانيكي والانزيميه، وانتشار (3) ميوبلاست والتفريق (4) ويعيش التصوير لتعقب الأنوية داخل ح 16 الأولى من التمايز ميوبلاست.
في الإجراء التالي، وتعزل من الفئران H2B-التجارة والنقل ميوبلاستس وتعامل مع 1 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير H2B-التجارة والنقل، كما هو موضح سابقا10. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل ميوبلاستس من الفئران المحورة وراثيا الأخرى التي تعبر عن بروتين فلوري في النواة أو ترانسفيكت الخلايا المعزولة من الفئران البرية من نوع للتعبير عن بروتين فلوري في النواة، كما هو موضح بيمنتل et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
ألياف العضلات (ميوفيبيرس) هي خلايا مولتينوكليتيد التي يتم تشكيلها من قبل دمج خلايا السلائف العضلات (myoblasts) المستمدة من الخلايا الجذعية العضلية (خلايا الأقمار الصناعية) التي يخضع لها الانتشار والتمايز2،3، 4. تقييم التمايز ميوبلاست، الإجرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل قبل فؤاد-الحفل الخيري إلى أ. ف. (#21545) ومنحة البذور المستشفى سان رافائيل (OSR) إلى S.Z. (ZAMBRA5X1000). الدكتور جان-إيف تينيفيز من “مركز تحليل الصورة” من معهد باستور المسلم لتقاسم علنا إجراءات MATLAB “تعقب بسيطة” له.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
