Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão
Summary
Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.
Abstract
Posicionamento nuclear dentro de células é importante para vários processos celulares em desenvolvimento e regeneração. O exemplo mais intrigante de posicionamento nuclear ocorre durante a diferenciação do músculo esquelético. Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas, formadas pela fusão de células precursoras dos músculos (mioblastos) derivadas de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação. Correto posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função. O procedimento comum para avaliar a formação de diferenciação e miofibras myoblast se baseia em células fixas analisadas por imunofluorescência, que dificulta o estudo do comportamento de movimento e célula nuclear ao longo do tempo. Aqui, descrevemos um método para a análise da formação de diferenciação e miofibras myoblast por imagens de células vivas. Nós fornecemos um software automatizado de controle nuclear obter uma caracterização quantitativa da elevado-produção de nuclear dinâmica e comportamento de myoblast (ou seja, a trajetória) durante a diferenciação e fusão.
Introduction
Músculo esquelético é o tecido maior no corpo humano, totalizando 35% – 40% da massa do corpo1. Células satélites são células-tronco musculares, anatomicamente caracterizadas por sua posição (justaposta a membrana plasmática, por baixo da lâmina basal das fibras musculares), que dão origem à proliferação de mioblastos (células progenitoras miogênico), que eventualmente diferenciar e integrar myofibers existentes e/ou fusível para formulário novo myofibers2,3,4. O progresso no estudo de sua biologia e sua descoberta levou a insights significativos sobre o desenvolvimento muscular e regeneração.
Protocolos para isolar e diferenciar mioblastos em myotubes foram desenvolvidos há muitos anos e ainda são largamente usados para estudar o músculo esquelético diferenciação5,6,7. No entanto, a maioria desses métodos representa procedimentos estáticos que dependem da análise de células fixas e, consequentemente, não permitir que os cientistas a explorar plenamente os processos altamente dinâmicos, como fusão de myoblast e maturação de miofibras. O exemplo mais marcante é o posicionamento nuclear, que é fortemente regulamentado, com núcleos inicialmente no centro das miofibras e, em seguida, localizada na periferia das miofibras maturação8,9. Imagem ao vivo é a técnica mais apropriada para obter ainda mais insights sobre um fenômeno tão peculiar.
Aqui, descrevemos um método que permite aos cientistas para gravar myoblast formação de diferenciação e myotube pela microscopia de lapso de tempo e realizar análises quantitativas do rastreamento automático de núcleos myoblast. Este método fornece uma caracterização quantitativa da elevado-throughput de nuclear dinâmica e myoblast comportamento durante a diferenciação e fusão. O protocolo é dividido em quatro partes diferentes, ou seja, (1) a coleção dos músculos de um dos membros posteriores dos ratos, (2) o isolamento dos mioblastos primários que consiste na digestão enzimática e mecânico, (3) myoblast proliferação e diferenciação e (4) viva da imagem latente para rastrear núcleos dentro o primeiro 16 h de diferenciação myoblast.
No procedimento a seguir, mioblastos são isolados de ratos H2B-GFP e tratados com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP, como descrito anteriormente,10. Alternativamente, é possível isolar os mioblastos de outros ratos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente no núcleo ou transfect as células isoladas de ratos do selvagem-tipo de expressar uma proteína fluorescente no núcleo, conforme descrito por Pimentel et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas que são formadas pela fusão de células precursoras de músculo (mioblastos) derivada de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação2,3, 4. Para avaliar a diferenciação de myoblast, o procedimento comum consiste de cultivo mioblastos em diferenciar médio e fixação das células em pontos de tempo diferentes p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela AFM-Teleton para E.V. (#21545) e pela Ospedale San Raffaele (OSR) semente subvenção para S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez do centro de análise de imagem do Institut Pasteur é reconhecido por compartilhar publicamente suas rotinas MATLAB “Simples Tracker”.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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