筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。
Summary
骨格筋は、特に核の配置に依存する非常にダイナミックなプロセスです。ここでは、我々 は筋芽細胞の分化と筋層の間の生きているセルイメージ投射によって核の動きを追跡する自動追跡から情報を抽出することにより核動態の定量的な解析を実行する方法をについて説明します。
Abstract
細胞内の核の配置、開発および再生の複数の細胞プロセスが重要です。核の配置の最も興味深い例は骨格筋の中に発生します。筋繊維 (筋線維) が筋前駆細胞 (筋芽細胞) 由来の筋幹細胞 (サテライト細胞) の増殖と分化を融合して多核巨細胞の細胞です。筋線維内の正しい核配置は、適切な筋肉の再生と機能に必要です。筋芽細胞の分化と筋線維の形成を評価する共通のプロシージャは、蛍光抗体法により、時間の経過とともに核の運動と細胞挙動の研究を妨げる用いて固定セルに依存します。ここでは、生細胞イメージングによる筋芽細胞の分化と筋線維の形成の解析手法について述べる.分化と融合の中に細胞核ダイナミクスと筋芽細胞挙動 (すなわち、軌道) の高スループットの定量的な特徴づけを取得する自動核追跡のためのソフトウェアを提供します。
Introduction
骨格筋は、本体質量1の 35-40% を合計、人間の体内で最大の組織です。衛星細胞は筋肉細胞、増殖筋芽細胞 (筋前駆細胞) を生じさせる、(細胞膜、筋線維の基底膜下に並べ)、彼らの位置によって特徴付けられる解剖学的結果となった区別するため、既存の筋線維に統合および/またはフォーム新しい筋線維2,3,4ヒューズします。彼らの発見と生物学の研究の進展は、筋肉の発達と再生に重要な洞察力につながっています。
分離し、単に筋芽細胞を分化するプロトコルは何年も前に開発されているおよびまだ広く骨格筋分化5,6,7を調べるために用い。ただし、これらのメソッドのほとんどは、固定細胞の解析に依存し、その結果、筋芽細胞の融合や筋線維の成熟などの非常に動的なプロセスを完全に探検する科学者を許可しない静的なプロシージャを表します。最も顕著な例は、しっかりと規制されており、初期状態で筋線維の中心核と、筋線維の成熟8,9後周辺に位置しを核配置です。ライブ イメージングは、さらに特有の現象についての洞察を取得する最も適切な手法です。
ここでは、科学者タイムラプス顕微鏡による筋芽細胞の分化と筋の形成を記録し、筋芽細胞核の自動追跡から定量的な解析を実行することができる手法について述べる。このメソッドは、分化と融合の中に核ダイナミクスと筋芽細胞挙動の高スループットの定量的な解析を提供します。プロトコルは分かれて 4 つさまざまな部分、すなわち (1) コレクション (2) マウスの後肢筋の機械的および酵素の消化力、(3) 筋芽細胞増殖、分化および (4) は、プライマリの筋芽細胞の分離ライブ イメージング筋芽細胞分化の最初 16 h 内の核を追跡します。
次の手順で筋芽細胞は H2B GFP マウスから隔離され、前述10として、H2B GFP 発現のためのドキシサイクリン 1 μ g/mL で処理しました。また、核の蛍光蛋白質の表現他のトランスジェニック マウスから筋芽細胞を分離する、または前述のピメンテルらによる核の蛍光蛋白質を表現する野生型マウスから分離した細胞を使って可能です。9。
Protocol
Representative Results
Discussion
筋繊維 (筋線維)、多核巨細胞の細胞増殖と分化の2,3を受ける筋幹細胞 (サテライト細胞) 由来筋前駆細胞 (筋芽細胞) の融合によって形成されます。 4。媒体を区別し、MyHC、分化のマーカーとの染色の染色蛍光抗体法を実行する異なる時点で細胞を固定で筋芽細胞を培養筋芽細胞分化を評価するには、一般的な手順ので構成?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事はあった e. v. (#21545) に AFM テレソンでチェッポ サン ラッファエッレ (OSR) シード権利を与えられた S.Z. (ZAMBRA5X1000) でサポートされています。パスツール研究所の画像解析ハブから博士ジャン = イヴ Tinevez 彼の「単純なトラッカー」MATLAB ルーチンを公開共有するため認められています。
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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