在成细胞分化和融合过程中利用活成像跟踪核
Summary
骨骼肌分化是一个高度动态的过程, 它特别依赖于核定位。在这里, 我们描述了一种方法, 以跟踪核运动的活细胞成像在成肌细胞分化和肌管形成, 并执行核动力学的定量表征, 从自动跟踪提取信息。
Abstract
细胞内的核定位对于发育和再生过程中的多个细胞过程非常重要。核定位最有趣的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 融合而成的多核细胞, 这些细胞经历增殖和分化。肌纤维内的正确核定位是正确的肌肉再生和功能所必需的。评估成肌细胞分化和肌纤维形成的常见程序依赖于免疫荧光分析的固定细胞, 这阻碍了随着时间的推移对核运动和细胞行为的研究。在这里, 我们描述了一种方法来分析成肌细胞分化和肌纤维形成的活细胞成像。我们提供了一个自动核跟踪软件, 以获得在分化和融合过程中核动力学和成肌细胞行为 (即轨迹) 的高通量定量表征。
Introduction
骨骼肌是人体最大的组织, 总数占人体质量的 35%-40% 1.卫星细胞是肌肉干细胞, 解剖上的特征是它们的位置 (并列于质膜, 在肌肉纤维的基层下), 从而导致成肌细胞 (成肌祖细胞) 的增殖, 最终区分并集成到现有的肌纤维和/或熔断器中, 形成新的肌纤维2,3,4。他们的发现和生物学研究的进展使人们对肌肉发育和再生有了重要的了解。
分离成肌细胞并将其分化为肌支管的协议早在多年前就已开发出来, 目前仍被广泛用于研究骨骼肌分化5, 6,7.然而, 这些方法大多代表了依赖于固定细胞分析的静态过程, 因此, 不允许科学家充分探索高度动态的过程, 如成肌细胞融合和肌纤维成熟。最突出的例子是核定位, 这是严格管制, 与原子核最初在肌纤维的中心, 然后, 位于周围的肌纤维成熟 8,9。实时成像是获得对这种特殊现象的进一步洞察的最适当的技术。
在这里, 我们描述了一种方法, 使科学家能够记录成肌细胞分化和肌管形成的延时显微镜, 并从自动跟踪成肌细胞核进行定量分析。该方法为分化和融合过程中的核动力学和成肌细胞行为提供了高通量的定量表征。该方案分为四个不同的部分, 即 (1) 从小鼠后肢收集肌肉, (2) 分离由机械和酶消化组成的原代成肌细胞, (3) 成肌细胞增殖和分化; (4)活体成像, 以跟踪成肌细胞分化前16小时内的细胞核。
在下面的过程中, 肌细胞从 H2B-gfp 小鼠中分离出来, 并用多西环素1μgml 进行治疗, 以诱导 H2B-gfp 表达, 如前面所述的 10。或者, 可以从其他在细胞核中表达荧光蛋白的转基因小鼠中分离成肌细胞, 也可以转染从野生小鼠体内分离出的细胞, 以表达细胞核中的荧光蛋白, 如 Pimentel 等人所述。9个。
Protocol
Representative Results
Discussion
肌肉纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 的融合而形成的多核细胞, 这些细胞经历了 2,3的增殖和分化, 4. 我的工作是什么？为了评估成肌细胞的分化, 常见的程序包括培养成肌细胞在分化培养基和固定细胞在不同的时间点进行免疫荧光染色肌红器, 一个分化的标记, 和染色带 dna 插层分子 (例如, Hoechst)的细…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 AFM-Telethon 至 e. v. (#21545) 和 Osedale San Raffaele (OSR) 对 s. z. 的种子赠款 (ZAMBRA5X1000) 的支持。巴斯德研究所图像分析中心的 Jean-yf·蒂涅克斯博士因公开分享他的 “简单跟踪者” MATLAB 例程而受到认可。
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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