Использование живых изображений для ядер трек во время Myoblast дифференциация и фьюжн
Summary
Очень динамичный процесс, который особенно зависит от ядерной позиционирования является дифференциация скелетных мышц. Здесь мы описываем метод для выполнения количественная характеристика динамики ядер путем извлечения информации из автоматического отслеживания и отслеживания движения ядер у Вообразимый живой клетки во время формирования дифференциации и myotube myoblast.
Abstract
Ядерные позиционирование внутри клетки имеет важное значение для нескольких клеточных процессов развития и регенерации. Наиболее интригующим примером ядерной позиционирования происходит во время дифференциация скелетных мышц. Многоядерные клетки, сформирована сплавливанием мышечных клеток-предшественников (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки мышечных волокон (myofibers). Правильное позиционирование ядерных в myofibers требуется для надлежащего мышечной регенерации и функции. Общие процедуры для оценки формирования дифференциации и myofiber myoblast опирается на фиксированные клетки анализируемой иммунофлюоресценции, который препятствует изучение поведения ядерных движения и клеток со временем. Здесь мы описываем метод для анализа myoblast дифференциация и myofiber формирования на живых клеток. Мы предоставляем программное обеспечение для автоматизированной ядерный отслеживания для получения количественной характеристики высок объём ядерного динамики и myoblast поведения (т.е. траектории) во время дифференциация и фьюжн.
Introduction
Скелетных мышц является крупнейшим ткани в организме человека, на сумму 35% – 40% массы тела1. Спутниковое клетки являются мышечных стволовых клеток, анатомически характеризуется их позицию (juxtaposed на плазматической мембране, под базальной пластинки мышечных волокон), дают основания для пролиферирующих сомитов (миогенных прогениторных клеток), который в конечном итоге дифференцировать и интегрировать в существующие myofibers и/или предохранитель в форме новых myofibers2,3,4. Их открытие и прогресс в изучении их биологии привело к значительным понимание развития мышц и регенерации.
Протоколы изоляции и дифференцировать сомитов в myotubes были разработаны много лет назад и до сих пор широко используются для изучения скелетных мышц дифференциация5,6,7. Однако большинство этих методов представляют собой статические процедур, которые полагаются на анализ фиксированных клеток и, следовательно, не позволяют ученым в полной мере изучить весьма динамических процессов, таких как слияние myoblast и myofiber созревания. Наиболее ярким примером является ядерная позиционирования, которая жестко регулируется, с ядрами первоначально в центре myofiber и, затем, расположенных на периферии после myofiber созревания8,9. Живой изображений является наиболее приемлемый метод для получения дальнейших понимание такой своеобразный феномен.
Здесь мы описываем метод, который позволяет ученым для записи myoblast дифференциация и myotube формирования покадровой микроскопии и выполнить количественный анализ от автоматического отслеживания myoblast ядер. Этот метод обеспечивает высок объём количественной характеристики ядерной динамики и myoblast поведения во время дифференциация и фьюжн. Протокол разделен на четыре части, а именно: (1) коллекции мышц от гомотерия мышей, (2) изоляции первичных сомитов, которая состоит в механических и ферментативного пищеварения, (3) myoblast распространения и дифференциации и (4) живой изображений для отслеживания ядер в течение первых 16 h myoblast дифференцировки.
В следующей процедуре сомитов изолированы от мышей H2B-GFP и относились с 1 мкг/мл доксициклин побудить H2B-GFP выражение, как описано выше10. В качестве альтернативы можно изолировать сомитов от других трансгенных мышей, которые выражают флуоресцентный белок в ядре или transfect клетки, изолированные от мышей дикого типа выразить флуоресцентный белок в ядре, как описано в Пиментел и др. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышечных волокон (myofibers) являются многоядерные клетки, которые образуются сплавливанием прекурсоров мышечных клеток (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки2,–3, <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа было поддержано AFM-телемарафон в е.в. (#21545) и Грант Seed Ospedale San Raffaele (OSR) для с.з. (ZAMBRA5X1000). Д-р Жан-Ив Tinevez от центра анализа изображения Пастера признал публично обмена его «Простой Tracker» MATLAB процедуры.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
