Utnytte Live bildebehandling til spor kjerner Myoblast differensiering og Fusion

Summary

Skjelettmuskel differensiering er en svært dynamisk prosess, som bruker spesielt kjernefysisk posisjonering. Her beskriver vi en metode å spore kjerner bevegelser av levende celle tenkelig under myoblast differensiering og myotube formasjon og utføre kvantitativ karakteristikk av kjerner dynamikken ved gitt informasjon automatisk sporing.

Abstract

Kjernefysisk posisjonering i celler er viktig for flere cellulære prosesser i utvikling og regeneration. Det mest spennende eksempelet på kjernefysiske posisjonering oppstår under Skjelettmuskel differensiering. Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler av fusjon av muskel precursor celler (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering. Riktig kjernefysiske posisjonering i myofibers er nødvendig for riktig muskulære og funksjon. Den vanlige prosedyren for å vurdere myoblast differensiering og myofiber formasjon er avhengig av faste celler analysert av immunofluorescence, som hindrer studiet av kjernefysiske bevegelse og celle oppførsel over tid. Her beskriver vi en metode for analyse av myoblast differensiering og myofiber dannelsen av levende celle tenkelig. Vi tilbyr en programvare for automatisert kjernefysiske sporing å få høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast atferd (dvs. banen) under differensiering og fusion.

Introduction

Skjelettmuskulatur er den største vev i kroppen, totalt 35% – 40% av kroppen masse¹. Satellitt celler er muskel-stamceller, anatomisk preget av sin posisjon (satt sammen til plasma membranen, under den basale lamina av muskel fiber), som gir opphav til voksende myoblasts (myogenic stamfar celler), som til slutt skille og integrere i eksisterende myofibers og/eller sikring til skjemaet ny myofibers^2,3,4. Funnet og fremgang i studiet av deres biologi har ført til betydelig innsikt i muskelutvikling og regeneration.

Protokoller å isolere og skille myoblasts i myotubes har blitt utviklet mange år siden og fortsatt er mye brukt til å studere Skjelettmuskel differensiering^5,6,7. Men representerer de fleste av disse metodene statisk prosedyrer som stole på analyse av fast celler, og derfor tillater ikke forskere helt utforske svært dynamisk prosesser, for eksempel myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksemplet er kjernefysiske posisjonering, som er strengt regulert, med kjerner først i midten av myofiber, og deretter plassert i periferien etter myofiber modning^8,9. Live bildebehandling er den mest passende teknikken for å få ytterligere innsikt i så merkelig fenomen.

Her beskriver vi en metode som gjør at forskerne å registrere myoblast differensiering og myotube dannelsen av time-lapse mikroskopi og utføre kvantitative analyser fra den automatiske sporingen av myoblast kjerner. Denne metoden gir høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast oppførsel under differensiering og fusion. Protokollen er delt inn i fire ulike deler, nemlig (1) samling av musklene hindlimbs mus, (2) isolering av primære myoblasts som består av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen, (3) myoblast spredning og differensiering og (4) Live bildebehandling spore kjerner innenfor de første 16 h myoblast differensiering.

Fremgangsmåten er myoblasts isolert fra H2B-GFP mus og behandlet med 1 µg/mL av doxycycline å indusere H2B-GFP uttrykk, som beskrevet tidligere¹⁰. Alternativt er det mulig å isolere myoblasts fra andre transgene mus som uttrykker et fluorescerende protein i kjernen eller transfect celler isolert fra vill-type mus å uttrykke et fluorescerende protein i kjernen, som beskrevet ved Pimentel et al. ⁹.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av San Raffaele institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. 1. Disseksjon av musen hindlimb muskler Sterilisere pinsett og saks (både rette og buede) av autoklavering. Forberede og filtrere (0.22 µm) alle media (blokkerer medium, fordøyelsen medium, voksende medium, og skiller middels) før du starter eksperimentet (se Tabell for materiale). Sett 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) i 35…

Representative Results

Å automatisk følge kjernefysiske bevegelse under myoblast differensiering i live bildebehandling, skal kjerner fortrinnsvis være fluorescently merket. Det er viktig å merke seg at ved hjelp av DNA-intercalating molekyler ikke er mulig fordi disse molekylene forstyrre spredning og differensiering av primære myoblasts13. Som et eksempel, er spredning og differensiering analysert i primære myoblasts kultivert med eller uten Hoechst (figur 1<…

Discussion

Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler som dannes ved blanding av prekursorer muskelceller (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering^{2,3, 4}. For å vurdere myoblast differensiering, består den felles prosedyren av dyrking myoblasts skille medium og feste cellene på ulike tidspunkt å utføre immunofluorescence flekker for MyHC, en markør av differensiering og …

Materials

chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um