Att utnyttja levande Imaging till spår kärnor under gorgina differentiering och Fusion
Summary
Skelettmuskulaturen differentiering är en mycket dynamisk process, som särskilt bygger på nukleära positionering. Här, beskriver vi en metod att spåra atomkärnor rörelser av levande cell imaging under gorgina differentiering och myotube bildning och utföra en kvantitativ karakterisering av atomkärnor dynamik genom att extrahera information från automatisk spårning.
Abstract
Nukleära positionering inom celler är viktigt för flera cellulära processer i utveckling och förnyelse. Det mest spännande exemplet på nukleära positionering sker under skelettmuskulaturen differentiering. Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler bildas genom fusion av föregångare muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering. Korrekt nukleära positionering inom myofibers krävs för korrekt muskel förnyelse och funktion. Det enhetliga förfarandet att bedöma gorgina differentiering och myofiber bildandet är beroende av fasta cellerna analyseras av immunofluorescens, vilken hindrar studiet av kärntekniska rörelsen och cell beteende över tid. Här, beskriver vi en metod för analys av gorgina differentiering och myofiber bildandet av levande cell imaging. Vi erbjuder en programvara för automatiserad nukleära tracking för att få en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende (dvs banan) under differentiering och fusion.
Introduction
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i den mänskliga kroppen, totalt 35-40% av kroppen massa1. Satellit celler är muskelstamceller, anatomiskt kännetecknas av deras position (kontrasteras till plasmamembranet, under den basala lamina av muskelfibrer), som ger upphov till prolifererande myoblasts (myogenic progenitorceller), som så småningom differentiera och integrera i befintliga myofibers eller säkring till formuläret ny myofibers2,3,4. Deras upptäckt och framsteg i studien av deras biologi har lett till betydande insikter i muskelutveckling och förnyelse.
Protokoll att isolera och differentieras myoblasts till myotubes har utvecklats för många år sedan och fortfarande ofta används för att studera skelettmuskulaturen differentiering5,6,7. De flesta av dessa metoder utgör dock statiska procedurer som förlitar sig på en analys av fasta celler och, följaktligen, inte tillåter forskare att fullt utforska högdynamiska processer, såsom gorgina fusion och myofiber mognad. Det mest slående exemplet är kärnkraft positionering, som är hårt reglerad, med kärnor från början i mitten av myofiber och, sedan, ligger på periferin efter myofiber mognad8,9. Levande imaging är den lämpligaste tekniken för att få ytterligare insikter om sådant märkliga fenomen.
Här beskriver vi en metod som gör det möjligt för forskare att registrera gorgina differentiering och myotube bildandet av time-lapse Mikroskopi och utföra kvantitativa analyser från automatisk spårning av gorgina atomkärnor. Denna metod ger en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende under differentiering och fusion. Protokollet är uppdelad i fyra olika delar, nämligen (1) samling av muskler från bakbenen av möss, (2) isolering av primära myoblasts som består i mekaniska och enzymatisk nedbrytning, (3) gorgina proliferation och differentiering och (4) Live imaging att spåra atomkärnor inom de första 16 h gorgina differentiering.
I följande procedur, är myoblasts isolerade från H2B-GFP möss och behandlas med 1 µg/mL av doxycyklin att inducera H2B-GFP uttryck, som tidigare beskrivits10. Alternativt är det möjligt att isolera myoblasts från andra transgena möss som uttrycker ett fluorescerande protein i cellkärnan eller transfect celler isolerade från vildtyp möss att uttrycka ett fluorescerande protein i cellkärnan, som beskrivs av Pimentel et al. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler som bildas genom fusion av prekursorer muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering2,3, 4. För att bedöma gorgina differentiering, består det gemensamma förfarandet av odlingsskålar myoblasts gäller att differentiera medium och åtgärda cellerna vid olika tidpunkter att utföra immunofluorescen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av AFM-Telethon att E.V. (#21545) och Ospedale San Raffaele (OSR) utsäde bidraget till S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez från navet bild analys av Institut Pasteur är erkänt för att offentligt dela sin ”enkel Tracker” MATLAB-rutiner.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
