Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen
Summary
Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.
Abstract
Alveolaire macrofagen (AMs) bewaken de alveolaire ruimte van de longen. Fagocytose door AMs speelt een cruciale rol in de verdediging tegen invasie ziekteverwekkers, het verwijderen van dode cellen of lichaamsvreemde deeltjes, en in de resolutie van de inflammatoire reacties en weefsel remodeling, verwerkt die worden bemiddeld door verschillende oppervlakte receptoren van de AMs. Hier, rapporteren we methoden voor de analyse van de fagocytische functie van AMs met behulp van in vitro en in vivo tests en experimentele strategieën om te differentiëren tussen de patroon erkenning receptor – aanvulling receptor- en Fc gamma receptor-gemedieerde fagocytose. Tot slot bespreken we een methode om te stellen en een model van de longontsteking P. aeruginosa bij muizen te beoordelen van bacteriële goedkeuring in vivo karakteriseren. Deze testen vormen de meest voorkomende methoden te evalueren AM functies en kunnen ook worden gebruikt om te studeren macrofaag functie en bacteriële mijnen in andere organen.
Introduction
AMs zijn de grote resident fagocyten in de longblaasjes in de rust stadium en één van de belangrijke spelers van aangeboren immuunresponsen door de erkenning en de internalisering van de geïnhaleerde ziekteverwekkers en lichaamsvreemde deeltjes1,2. Er werd gemeld dat AMs essentieel voor de snelle goedkeuring van de vele pulmonaire ziekteverwekkers zoals P. aeruginosa en Klebsiella longontsteking3,4, zijn dus een tekort aan AM fagocytose vaak in respiratoire resulteert infecties, zoals acute longontsteking, waardoor hogere mortaliteit en morbiditeit tarieven.
AMs ook aangeboren inflammatoire reacties in de longen door de productie van cytokines en chemokines zoals TNF-α en IL-1β, welke Overspraak met andere cellen van de alveolaire milieu te produceren chemokines en werven van inflammatoire neutrofiele granulocyten, monocyten, starten en adaptieve immune cellen in de longen5. Bijvoorbeeld, helpt IL-1β, geproduceerd door AMs om de vrijlating van de neutrofiele chemokine CXCL8 van epitheliale cellen6prime. Bovendien, AMs bijdragen aan de fagocytose van apoptotic polymorfonucleaire leukocyten (PMNs), niet van die leidt tot de aanhoudende lekkage van intracellular enzymen uit PMNs het omgevende weefsel, wat resulteert in weefselschade en langdurige ontsteking 7 , 8 , 9.
Fagocytose door de AMs is bemiddeld door een directe erkenning van pathogen-geassocieerde moleculaire patronen aan het oppervlak van de ziekteverwekker door de patroon erkenning receptoren (PRRs) van de AMs of door de binding van opsonized pathogenen met immuun effector receptoren van de AMs 10. voor het laatste, AMs herkent de doelstellingen opsonized met immunoglobuline (IgG) via hun Fcγ receptoren (FcγR) of de ziekteverwekkers bekleed met aanvulling fragmenten, C3b en C3bi, door hun aanvulling receptoren (CR),11. Onder aanvulling receptoren, de CR van de immunoglobuline superfamilie (CRIg) wordt selectief uitgedrukt in weefsel macrofagen12, en een recente bevinding benadrukte de rol van de CRIg in AM fagocytose in het kader van P. aeruginosa longontsteking 13.
Veel originele studies methoden gebruiken om te evalueren van de macrofaag fagocytose om te beschrijven van de moleculaire mechanismen van macrofaag functie14,15. Methoden zoals in vivo fagocytose vereisen echter een precieze kwantificering van fagocytose. Hier, we vatten een gedetailleerde methodologie voor zowel in vitro en in vivo fagocytose met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-glazen kralen en P. aeruginosa groen fluorescente proteïne (GFP), respectievelijk. Verder, verklaren wij de methode van differentiëren tussen PRR-, CR- en FcγR-gemedieerde fagocytose. Tot slot melden wij een methode te karakteriseren van bacteriële mijnen in muis met betrekking tot P. aeruginosa longontsteking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens het uitvoeren van een gas uitwisseling functie, confronteert de Long hardnekkig lichaamsvreemde deeltjes, pathogenen en allergenen. AMs zijn de eerste verdedigingslinie uit hoofde van hun belangrijkste functie, namelijk fagocytose. AMs ook coördineren met andere immuuncellen in het vernietigen van de ziekteverwekkers en in de resolutie van de ontsteking. Hier, beschreven we methoden voor de beoordeling van specifiek fagocytose door AMs geïsoleerd van de muis Long. Het protocol gepresenteerd in dit manuscript ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de toekenning van R01HL116826 aan X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
