Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones
Summary
Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.
Abstract
Los macrófagos alveolares (AMs) guardan el espacio alveolar del pulmón. Fagocitosis por AMs juega un papel fundamental en la defensa contra los invasores patógenos, la eliminación de células muertas o partículas extrañas y en la resolución de las respuestas inflamatorias y la remodelación tisular, procesos que son mediados por receptores distintos de la superficie de las AMs. Aquí, Divulgamos los métodos para el análisis de la función fagocítica de AMs usando estrategias experimentales y ensayos in vitro e in vivo para diferenciar entre el receptor de reconocimiento patrón-, receptor de complemento- y Fc gamma mediada por receptor fagocitosis. Finalmente, se discute un método para establecer y caracterizar un modelo de neumonía de p. aeruginosa en ratones para evaluar in vivo la eliminación bacteriana. Estos ensayos representan los métodos más comunes para evaluar las funciones de AM y también pueden utilizarse para estudiar la función de macrófagos y de remoción bacteriana en otros órganos.
Introduction
AMs son los principales fagocitos residente en los alvéolos en la etapa de descansa y uno de los principales actores de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento y la internalización de patógenos inhalados y partículas1,2. Se ha reportado que AMs son esencial para la separación rápida de muchos patógenos pulmonares, como p. aeruginosa y Klebsiella pneumoniae3,4, por lo que una deficiencia en la fagocitosis de AM con frecuencia resulta en respiratorias infecciones, como neumonía aguda, que causan mayores tasas de mortalidad y morbilidad.
AMs también iniciar innatas respuestas inflamatorias en el pulmón mediante la producción de citoquinas y quimioquinas como TNF-α y IL-1β, que interferencia con otras células del ambiente alveolar para producir quimiocinas y reclutar inflamatorias neutrófilos, monocitos, y células inmunes adaptantes en el pulmón5. Por ejemplo, IL-1β producido por AMs ayuda a la liberación de lo neutrófilo chemokine CXCL8 de células epiteliales6. Por otra parte, el AMs contribuyen a la fagocitosis de la apoptosis de leucocitos polimorfonucleares (PMNs), fracaso del que conduce a la pérdida sostenida de enzimas intracelulares de PMNs al tejido circundante, resultando en daño tisular y la inflamación prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitosis por las AMs está mediada por un reconocimiento directo de patrones moleculares asociados a patógenos en la superficie de patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) de las AMs o por la Unión de patógenos opsonizadas con receptores inmunes efectoras de las AMs 10. para este último, AMs puede reconocer los objetivos opsonizadora con inmunoglobulina (IgG) a través de sus receptores de Fcγ (FcγR) o los patógenos recubiertos de fragmentos del complemento, C3b y C3bi, a través de sus receptores de complemento (CR)11. Entre los receptores del complemento, el CR de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CRIg) se expresa selectivamente en los macrófagos de tejido12, y un reciente hallazgo destacó el papel del CRIg en fagocitosis de AM en el contexto de la pulmonía de p. aeruginosa 13.
Muchos estudios originales utilizan métodos para evaluar la fagocitosis de macrófagos para describir los mecanismos moleculares de la función de macrófagos14,15. Sin embargo, métodos como la fagocitosis in vivo requieren una cuantificación precisa de la fagocitosis. Aquí, se resume una metodología detallada para la fagocitosis in vitro e in vivo con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-cristal granos y proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Además, se explica el método de diferenciar entre PRR, CR y fagocitosis mediada por FcγR. Por último, se presenta un método para caracterizar la remoción bacteriana en ratón con respecto a p. aeruginosa neumonía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al realizar una función de intercambio de gas, el pulmón persistente se enfrenta a alérgenos, agentes patógenos y partículas extrañas. AMs proporcionan la primera línea de defensa en virtud de su función principal, es decir, fagocitosis. AMs también coordinar con otras células a destruir los patógenos y en la resolución de la inflamación. Aquí, hemos descrito los métodos para evaluar específicamente la fagocitosis por AMs aislada del pulmón del ratón. El protocolo presentado en este manuscrito, explica …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por beca R01HL116826 a X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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