치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스
Summary
여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
치경 세포 (AMs)는 폐의 폐 포 공간 경비. AMs에 의해 먹어서 침입 병원 체, 죽은 세포 또는 외국 입자의 제거에 대 한 방어에 중요 한 역할을 한다 그리고 염증 반응과 조직 리 모델링의 해상도, 처리의 다양 한 표면 수용 체에 의해 중재 AMs입니다. 여기, 우리는 패턴 인식 수용 체-, 보완 수용 체 및 Fc 감마 수용 체-중재를 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험 및 실험적인 전략을 사용 하 여 AMs의 phagocytic 기능 분석에 대 한 방법을 보고합니다 식 균 작용입니다. 마지막으로, 설정 하 고 세균성 클리어런스 vivo에서 평가 하기 위해 쥐에 피 녹 농 균 폐 렴 모델을 특성화 하는 방법을 다루겠습니다. 이 분석 실험 오전 기능을 평가 하는 가장 일반적인 방법을 대표 하 고 또한 대 식 세포 기능 및 다른 기관에서 세균 정리를 공부 하는 데 사용 수 있습니다.
Introduction
AMs는 휴식 단계와 중 인정을 통해 타고 난 면역 반응의 주요 선수와 흡입된 병원 체와 외국 입자1,2의 국제화에는 폐 포에서 주요 거주 식 세포. 그것은 알려졌다 그래서 오전 먹어서 결핍 호흡에 종종 결과 AMs P. 녹 농 균 및 Klebsiella 폐 렴3,4, 등 많은 폐 병원 균의 급속 한 정리를 위한 필수적입니다. 감염, 급성 폐 렴과 같은 더 높은 사망률과 병 적 속도 일으킬.
AMs는 또한 cytokines 및 발산 TNF-α, IL 1β, 생산 발산 하 여 염증 성 호 중구, monocytes, 모집 치경 환경의 다른 세포와는 누화 등을 생산 하 여 폐에 타고 난 선 동적인 응답을 시작 하 고 적응 면역 세포 폐5에. 예를 들어 IL 1β AMs 제작한6상피 세포 호 중구 chemokine CXCL8의 릴리스를 도움이 됩니다. 또한, AMs apoptotic polymorphonuclear 백혈구 (PMNs)의 먹어서 주변 조직, 조직 손상의 결과로, 장기 염증 PMNs에서 세포내 효소의 지속적인된 유출에는 리드의 실패에 기여 7 , 8 , 9.
AMs에 의해 식 균 작용은 AMs의 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 또는 AMs의 수용 체 면역 이펙터와 opsonized 병원 체의 바인딩에 의해 병원 체 표면에 병원 체 관련 된 분자 패턴의 직접 인식 하 여 중재 10. 후자의 경우, AMs 그들의 Fcγ 수용 체 (FcγR)를 통해 면역 글로불린 (IgG)와 opsonized 목표를 인식할 수 또는 병원 체 코팅 보수 조각, C3b 및 C3bi, 그들의 보완의 수용 체를 통해 (CR)11. 보충 수용 체 중 면역 글로불린의 superfamily (CRIg)의 CR은 선택적으로 조직 세포12, 나타나며 최근 발견에 피 녹 농 균 폐 렴의 맥락에서 오전 먹어서 CRIg의 역할 강조 13.
많은 원래 연구 메서드를 사용 하 여 대 식 세포 기능14,15의 분자 메커니즘을 설명 하기 위해 대 식 세포 식 균 작용을 평가. 그러나, vivo에서 먹어서 같은 방법 식 균 작용의 정확한 정량화를 해야합니다. 여기, 우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 먹어서 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여에 대 한 상세한 방법론 요약-유리 구슬과 피 농 균 녹색 형광 단백질 (GFP), 각각. 또한, 우리 PRR, CR 및 FcγR 중재 먹어서 가운데 차별화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 피 농 균 폐 렴에 대해 마우스에 세균 정리 하는 방법을 보고 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가스 교환 기능을 수행 하는 동안 폐 지속적으로 외국 입자, 병원 체, 및 알레르기 증상을 직면 한다. AMs는 그들의 주요 기능, 즉 먹어서 덕택으로 방어의 첫 번째 줄을 제공합니다. AMs는 또한 다른 면역 세포는 병원 체를 파괴와 염증의 해상도 함께 조정. 여기, 우리가 구체적으로 AMs 마우스 폐에서 분리 하 여 식 균 작용을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. 이 원고에 프로토콜 먹어서 vivo에서 그…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 그랜트 R01HL116826 X. Zhao에 의해 지원 됩니다.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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