Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей
Summary
Здесь мы приводим общие методы для анализа фагоцитарную функцию мышиных альвеолярных макрофагов и бактериальных Распродажа из легких. Эти методы исследования в пробирке фагоцитоз флуоресцеин Изотиоцианаты бусы и в естественных условиях фагоцитоз Pseudomonas aeruginosa зеленого флуоресцентного белка. Мы также описывают метод для очистки P. aeruginosa мышей.
Abstract
Альвеолярных макрофагов (AMs) гвардии пространство альвеолярных легких. Фагоцитоз, AMs играет решающую роль в обороне против вторгаясь патогенов, удаление омертвевших клеток или посторонних частиц и в резолюции воспалительных реакций и тканей ремоделирования, процессов, посредничестве различные поверхности рецепторы AMs. Здесь мы приводим методы для анализа фагоцитарной функции с помощью экспериментальных стратегий и в vitro и in vivo анализов различать шаблон признание рецептор-, рецептор комплемента- и гамма Fc рецептор опосредованный AMs фагоцитоз. Наконец мы рассмотрим метод, чтобы установить и характеризуют P. aeruginosa пневмонии модели мышей для оценки бактериальных Распродажа в естественных условиях. Эти анализы являются наиболее распространенными методами для оценки функции AM и может также использоваться для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.
Introduction
АПП являются крупные резидентов фагоцитов в альвеолах в стадии покоя и один из основных игроков врожденные иммунные реакции через признание и интернализации ингаляционных патогенов и инородных частиц1,2. Сообщалось, что AMs имеют важное значение для быстрого разминирования многих легочных патогены, например P. aeruginosa и клебсиеллы пневмонии3,4, так что дефицит в AM фагоцитоза часто приводит к респираторных инфекции, такие как острая пневмония, которые вызывают более высокие показатели смертности и заболеваемости.
АПП также инициировать врожденной воспалительные реакции в легких, производство цитокинов и chemokines например ФНО α, ИЛ 1β, какой уровень помех с другими клетками альвеолярного среды для производства chemokines и набирать воспалительных нейтрофилов, моноцитов, и Адаптивная иммунные клетки в легких5. Например ИЛ 1β, производимые AMs помогает премьер высвобождение нейтрофилов хемокиновых CXCL8 из эпителиальных клеток6. Кроме того АПП способствовать фагоцитоз apoptotic полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ), отказ которых приводит к постоянной утечки внутриклеточных ферментов из ПНЛ окружающие ткани, что приводит к повреждению тканей и длительное воспаление 7 , 8 , 9.
Фагоцитоз, AMs опосредуется прямого признания патоген связанные молекулярные узоры на поверхности патогена шаблон признание рецепторов (ПРРС) АПП или привязки опсонизированными патогенов с рецепторами иммунной эффекторных АПП 10. для последнего, AMs может признать целей опсонизированными с иммуноглобулина (IgG) через их Fcγ рецепторы (FcγR) или патогенов с фрагментов комплемента, C3b и C3bi, через их дополнения рецепторов покрытием (CR)11. Среди дополнения рецепторов выборочно CR суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg) выражается в ткани макрофагами12, и недавнее заключение подчеркнул роль CRIg в AM фагоцитоза в контексте P. aeruginosa пневмонии 13.
Многие оригинальные исследования использовать методы для оценки фагоцитоз макрофага описать молекулярных механизмов макрофагов функция14,15. Однако методы как в естественных условиях фагоцитоза требуют точную количественную оценку фагоцитоза. Здесь, мы суммируем подробная методология для фагоцитоза в vitro и in vivo, используя флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-стеклянные бусы и P. aeruginosa Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), соответственно. Кроме того мы объяснить метод дифференциации среди PRR-, CR- и FcγR опосредованной фагоцитоза. Наконец мы сообщаем метод характеризовать бактериальных Распродажа в мыши отношении P. aeruginosa пневмонии.
Protocol
Representative Results
Discussion
При выполнении функции обмена газа, легких упорно противостоит посторонних частиц, патогенов и аллергенов. АПП обеспечивают первую линию обороны в силу их основная функция, а именно фагоцитоза. АПП также координировать с другими иммунные клетки в уничтожении патогенных микроорганизм?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Грант R01HL116826 X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
