Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde
Summary
Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.
Introduction
AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.
AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer5. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri6hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda 7 , 8 , 9.
AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği 10. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)11tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar12‘ seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak 13.
Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser grant R01HL116826 için X. Zhao tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
