Alveolar Macrophage fagocytose og bakterier klarering i mus
Summary
Her rapporterer vi vanlige metoder for å analysere phagocytic funksjon murine alveolar makrofager og bakteriell klaring fra lungene. Disse metodene studere i vitro fagocytose av fluorescein isothiocyanate perler og i vivo fagocytose Pseudomonas aeruginosa Green fluorescerende protein. Vi har også beskriver en metode for å fjerne P. aeruginosa i mus.
Abstract
Alveolar makrofager (AMs) vakt alveolar løpet av lungene. Fagocytose av AMs spiller en avgjørende rolle i forsvaret mot invaderende patogener, fjerning av død celler eller fremmede partikler og i oppløsning av inflammatoriske svar og vev remodeling, behandler som er formidlet av ulike overflate reseptorer av AMs. Her rapporterer vi metoder for analyse av den phagocytic AMs bruker i vitro og in vivo analyser og eksperimentelle strategier for å skille mellom den mønster anerkjennelse reseptor – supplement reseptor- og Fc gamma reseptor-mediert fagocytose. Til slutt, vi diskuterer en metode for å etablere og karakterisere P. aeruginosa lungebetennelse modell i mus å vurdere bakteriell klarering i vivo. Disse analyser representerer de vanligste metodene for å evaluere AM funksjoner og kan også brukes til å studere macrophage funksjon og bakteriell klarering i andre organer.
Introduction
AMs er de store bosatt phagocytes i alveoli hvile scenen og en av de store aktørene av medfødte immunreaksjoner gjennom erkjennelsen og internalization inhalert patogener og fremmede partikler1,2. Det har blitt rapportert at AMs er avgjørende for den raske klarering av mange lunge patogener som P. aeruginosa og Klebsiella lungebetennelse3,4, så en mangel på AM fagocytose ofte resulterer i luftveiene infeksjoner, som akutt lungebetennelse, som forårsake høyere dødelighet og sykelighet priser.
AMs også starte medfødte inflammatorisk svar i lungene ved å produsere cytokiner og chemokines som TNF-α og IL-1β, hvilke crosstalk med andre celler av alveolar miljøet å produsere chemokines og rekruttere inflammatorisk nøytrofile, monocytter, og adaptive immunceller i lungene5. For eksempel, hjelper IL-1β produsert av AMs Prime utgivelsen av nøytrofile chemokine CXCL8 fra epitelceller6. Videre bidra AMs til fagocytose av apoptotisk polymorfonukleære leukocytter (PMNs), feil som fører til vedvarende lekkasje av intracellulær enzymer fra PMNs til omkringliggende vev, som resulterer i skade på vev og langvarig betennelse 7 , 8 , 9.
Fagocytose av AMs er formidlet av en direkte anerkjennelse av patogen-forbundet molekylær mønster på patogen overflaten av mønster anerkjennelse receptors (PRRs) av AMs eller ved binding av opsonized patogener med immun effektor reseptorer av AMs 10. for sistnevnte AMs kan gjenkjenne mål opsonized med immunglobulin (IgG) gjennom deres Fcγ reseptorer (FcγR) eller patogener belagt med supplement fragmenter, C3b og C3bi, gjennom deres supplement reseptorer (CR)11. Blant supplement reseptorer, CR av immunglobulin gruppe (CRIg) er uttrykt selektivt i vev makrofager12, og en siste finne valgte CRIg i AM fagocytose i sammenheng med P. aeruginosa lungebetennelse 13.
Mange opprinnelige studier bruk metoder for å vurdere macrophage fagocytose å beskrive molekylære mekanismer macrophage funksjon14,15. Men krever metodene som i vivo fagocytose en presis kvantifisering av fagocytose. Her vi oppsummere en detaljert metodikk for både i vitro og in vivo fagocytose bruker fluorescein isothiocyanate (FITC)-glass perler og P. aeruginosa grønne fluorescerende protein (GFP), henholdsvis. Videre forklare vi metoden skille blant PRR – CR- og FcγR-mediert fagocytose. Til slutt, vi rapportere en metode for å beskrive bakteriell klaring musen med hensyn til P. aeruginosa lungebetennelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du utfører en gass exchange funksjon, konfronterer lungene vedvarende fremmede partikler, patogener og allergener. AMs gir den første linjen i forsvaret i kraft av deres viktigste funksjon, nemlig fagocytose. AMs også koordinere med andre immunceller i ødelegge patogener og oppløsningen av betennelse. Her beskrevet vi metoder for å vurdere spesielt fagocytose av AMs isolert fra mus lungene. Protokollen presentert i dette manuskriptet forklarer en detaljert studie av fagocytose både i vivo og in vitro, som ogs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av grant R01HL116826 til X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
