Summary
Het protocol wordt een reproduceerbare methode ontworpen voor gebruik met cel cultuur supernatant voor het opsporen van oppervlakte epitopes op kleine extracellulaire blaasjes (EV) beschreven. Het maakt gebruik van specifieke EV immunoprecipitation met parels in combinatie met de antilichamen die surface antigeen CD9 herkent, CD63, en CD81. De methode is geoptimaliseerd voor downstream stroom cytometry analyse.
Abstract
Stroom cytometry (FC) is de methode van keuze voor semi-kwantitatieve meting van celoppervlak antigeen markers. Onlangs, is deze techniek gebruikt voor analyses van de fenotypische van extracellulaire blaasjes (EV) met inbegrip van exosomes (Exo) in het perifere bloed en andere lichaamsvloeistoffen. De kleine grootte van EV mandaten het gebruik van speciale instrumenten met een detectie-drempel rond 50-100 nm. EV kan als alternatief worden gebonden aan latex microbeads die kunnen worden gedetecteerd door FC. Microbeads, geconjugeerd met antilichamen die EV-geassocieerde markeringen/Cluster van differentiatie CD63, CD9 en CD81 herkent kunnen worden gebruikt voor het vastleggen van de EV. Exo geïsoleerd van CM kan met of zonder pre verrijking door ultracentrifugatie worden geanalyseerd. Deze aanpak is geschikt voor EV analyses met behulp van conventionele FC instrumenten. Onze resultaten tonen aan dat een lineaire correlatie tussen bedoel fluorescentie intensiteit (MFI) waarden en EV concentratie. EV verstoren door ultrasoonapparaat dramatisch gedaald MFI, die aangeeft dat de methode geen membraan puin detecteert. Wij rapporteren een nauwkeurige en betrouwbare methode voor de analyse van EV oppervlakte antigenen, die eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium.
Introduction
Cellen afscheiden extracellulaire blaasjes (EV) van verschillende grootte, met inbegrip van microvesicles (MV) en exosomes (Exo). De laatste kan worden onderscheiden van MV door zowel de grootte als de subcellular compartiment van herkomst. MV (200-1000 nm in grootte) worden vrijgegeven uit bovenliggende cellen door het vergieten van het plasma-membraan. Omgekeerd, Exo (30 – 150 nm) zijn afkomstig uit de endosomal membranen en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte wanneer de multivesicular instanties (MVB) zekering met de celmembraan1,2.
EV worden steeds meer gebruikt als diagnostische biomarkers zo goed als, potentieel, therapeutische instrumenten op veel gebieden zoals oncologie, neurologie, cardiologie en musculoskeletale aandoeningen3,4,5. Een overgrote meerderheid van lopende studies met behulp van de EV als therapeutische middelen het isolement van de blaasjes van cel-geconditioneerd medium (CM) van de in vitro gekweekte cellen benutten. Mesenchymale stamcellen (MSCs) uitoefenen gunstige effecten in verschillende contexten, en MSC-afgeleide EV voordelen in modellen van myocardiale ischemie/reperfusie letsel6 en hersenen verwonding7hebben aangetoond. MSC-afgeleide EV vertonen ook immuun f activiteiten die kunnen worden benut om de behandeling van de verwerping van het immuunsysteem, zoals aangetoond in een model van therapie-vuurvaste graft - versus - host-ziekte8. Vruchtwater vloeistof stamcellen (hAFS) actief verrijken CM met MVs en Exo, ongelijkmatig verdeeld in grootte (50 – 1.000 nm), die verschillende biologische effecten, zoals verspreiding van gedifferentieerde cellen, angiogenese, remming van de fibrose, bemiddelen en cardioprotection4. Wij hebben onlangs aangetoond dat EV, en met name Exo, uitgescheiden door menselijke cardiale afkomstige voorlopercellen (Exo-CPC) verkleinen myocardiale infarct in ratten5,9.
Exo delen een gemeenschappelijke set van eiwitten op hun oppervlak, met inbegrip van tetraspanins (CD63, CD81, CD9) en grote histocompatibility complex klasse I (MHC-ik). Naast deze gemeenschappelijke set van eiwitten, Exo bevatten ook eiwitten specifiek voor de EV subset van het celtype producent. Exo-markeringen zijn vaandel wint, omdat ze een cruciale rol in de Inter cellulaire communicatie spelen, waardoor vele biologische processen5,10te reguleren. Vanwege het kleine formaat, het vinden van een gemakkelijke manier om het analyseren van de EV met behulp van klassieke stroom cytometry (FC) blijft een uitdagende taak.
Hier presenteren we een vereenvoudigde protocol voor EV-analyse met behulp van FC, die kan worden toegepast op verkregen via ultracentrifugatie vooraf verrijkte monsters of rechtstreeks naar CM (Figuur 1). Zonder extra wasbeurten gebruikt de methode kralen bedekt met een specifiek antilichaam dat canonieke Exo-geassocieerde oppervlakte epitopes (CD63, CD9, CD81 bindt). FC analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van een conventionele cytometer met geen noodzaak van aanpassingen voorafgaand aan metingen. Methoden voor de karakterisatie van antigenen op individuele kleine deeltjes met behulp van flow cytometers zijn beschreven door andere fracties met betrekking tot diverse toepassingen11,-12,13. Hier, we matiemaatschappij magnetische kralen gebruikt voor het vangen van kleine deeltjes en Exo, gevolgd door fenotypering van gevangen deeltjes door FC. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de antigene samenstelling van kleine blaasjes uitgebracht door elk celtype in vitro, mits hier we specifieke cel cultuur voorwaarden die van toepassing zijn voor de cultuur van menselijke cardiale voorlopercellen (CPC) en de meeste passende omgeving voor de productie van de EV door deze cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. verzameling en verwerking van geconditioneerde Media
- Jas 55 cm2 petrischaaltjes met 0,02% varkens huid gelatine in PBS.
- Plaat (8000/cm2) CPC in vooraf gecoate gerechten met 7 mL van Iscove van bewerkt Dulbecco Medium (IMDM) aangevuld met 20% FBS (foetale runderserum) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).
Opmerking: De term "CPC" verwijst naar menselijke explant afgeleide cellen die al beschreven elders14. CM kan worden verzameld van verschillende celtypes gekweekt in specifieke cultuuromstandigheden. Draag handschoenen en werken onder een biologische motorkap. - Zodra cellen bereiken over 80% samenvloeiing, verwijderen van het kweekmedium, cellen tweemaal met Dulbecco van PBS (PBS) Ca - en Mg-gratis wassen en 10 mL van serumvrij Exo-productie medium (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium [DMEM] hoge Glucose, 4.5 g/mL) te vervangen.
Opmerking: Doorgaan met een geleidelijke daling van de serumconcentratie kweekmedium, geleidelijk aanpassen cellen serumvrij voorwaarde (SF). Voor cellen zijn gevoelig voor serumvrij medium bereiden een medium met FBS maar uitgeput van EV. Medium aangevuld met alle voedingsstoffen, plus 10%-20% (v/v) FBS voor te bereiden. Centrifugeer het medium's nachts 100.000 × g4 ° C. Wees ervan bewust dat deze procedure geen 100% verwijdering van FBS afkomstige EV garandeert. - Na 7 dagen, verzamelen de CM in een polypropyleen centrifuge buizen.
Opmerking: De tijd voor middellange conditionering is afhankelijk van het celtype. Voor cellen die gevoelig voor serumvrij medium zijn, verhoging van het aanvankelijke volume van medium en verminderen de tijd voor CM collectie tot en met 24-48 h. - Duidelijk CM uit cel puin door centrifuge op 3000 x g gedurende 20 minuten op 4-10 ° C. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie in een 100 kDa centrifugebuis filter.
- Concentraat CM gewist door het draaien van de buis bij 2.000 x g gedurende 20 minuten op 4-10 ° C.
Opmerking: Deze stap zal verminderen de aanvankelijke omvang van CM waardoor het gebruik van kleine hoeveelheden buizen voor hoge snelheid centrifuge stappen en zal bijdragen tot het elimineren van kleine eiwit-aggregaten. - Het verzamelen van het concentraat in een microcentrifuge buis. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 minuten op 4-10 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof verzamelen en gaat u verder met sectie 2 (EV verrijking). Als een ultracentrifuge niet beschikbaar gaat u rechtstreeks naar 3 (Nanoparticle Tracking analyse (NTA) kwantificering).
Opmerking: Pre verrijking van EV breuk verbetert definitieve uitlezing in intensiteit van de fluorescentie (Zie representatieve resultaten en Figuur 4). Gewiste CM (vanaf punt 1.8) kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor niet langer dan 1-2 dagen of anders op −80 ° C gedurende enkele maanden. 5 CM moet vooraf gewist te verwijderen elke cellulaire puin voordat u opbergt bij-80 ° C om ervoor te zorgen dat exosome en middelgrote puin niet in het bevriezen-ontdooien-proces wordt gevormd.
2. de extracellulaire blaasjes verrijking door Ultracentrifuge (optioneel)
- Plaats het supernatant uit stap 1.8 in een polycarbonaat dikke muur ultracentrifuge buis. Vul de buis met 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) totdat het bereikt de maximale capaciteit (3.2 mL).
- Laden van monsters in een titanium vaste-hoek rotor (8 x 3.2 mL, k-Factor 13). Laden van de rotor in een tafelblad ultracentrifuge. Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 3 uur bij 4-10 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 µL van 1 x PBS.
3. Nanoparticle Tracking (NTA) analytische kwantificering
- Verdunnen 1 µL van monster (van beide stap 2.3 of 1.8) in 999 µL van 1 x PBS. Het laden van het monster in een spuit van 1 mL, het vermijden van de vorming van de zeepbel. Laden van de spuit in de perszijde van de onderzoek-kamer.
- Inschakelen van de laser. Open de camera met de Capture knop. De focus aanpassen.
- Het opnemen van ten minste 3 verschillende frames van 60 s elke.
- Het analyseren van de 3 verschillende acquisities, met behulp van de optie Batchproces in de software.
Opmerking: Als de NTA-technologie niet beschikbaar is, voert u een kwantificering van de eiwitten door de analyse van Bradford (1 x 108 deeltjes correspondeert met 1 – 2 µg totaal eiwit na ultracentrifugatie of met 50 – 60 µg totaal eiwit als kwantificering wordt uitgevoerd direct voor CM als het bevat eiwitten contaminanten verschilt EV; Zie tabel 1)5.
4. de monstervoorbereiding
- Bereiden een pool van de 3 soorten vangen parels (parels van het CD9 CD63 kralen en CD81 kralen op een 1:1:1 verhouding; Zie Tabel van materialen) en vortex.
Opmerking: Het zwembad is getest om te worden stabiel gedurende 1 maand. Één type van het vastleggen van de kraal kan worden gebruikt, hierdoor kan de detectie van de EV subpopulatie niet discriminable met zwembad van parels. Met behulp van één antigeen vastleggen van parels, het is mogelijk om eigentijds tonen de aanwezigheid van eiwitten van de tetraspanin, zoals CD9, CD81 of CD63, en het antigeen van belang door fluorescerende antilichaam ontdekt. Alternatieve aldehyde-sulfaat latex kralen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Deze parels presenteren hydrophobic oppervlakte voor de adsorptie van MV en EV. - Toevoegen in een ronde onderkant-buis, het bedrag van het volume dat overeenkomt met 1 x 108 deeltjes plus 1 µL van het zwembad van de kraal, overeenkomt met 1.2 x 105 kralen in totaal (voor elke test).
- Een buis met 1 µL van parels zonder EV die als negatieve controle dienen zal, hierbij verwezen als "Parels" voor te bereiden.
- Stel het volume in op 100 µL met 1 x PBS. Plaats de buis in een thermo-mixer, en schudden bij 400 rpm's nachts op 4-10 ° C.
- De volgende dag, verplaats de monsters naar een ronde bodemplaat 96-Wells (of FC buizen).
- Het toevoegen van het antilichaam (10 µg/mL CD9_FITC 10 µg/mL CD63_PE en 5 µg Mn/mL CD81_PE).
- Incubeer 1 uur bij 4-10 ° C.
- Voeg 100 µL van 1 x PBS aan elk putje.
- Overgaan tot aankoop.
5. verwerving
- Open de acquisitie software en start van het instrument (Cytometer > systeem opstartprogramma). Open een nieuw experiment.
- Een experimentele-sjabloon maken en selecteer vervolgens plaat en vervolgens Toevoegen plaat. Selecteer de positie van de monsters op de plaat en druk op Instellen als monster goed.
- Voer de naam in monster (d.w.z. CPC #1_CD9FITC) in de Regels voor naamgeving. Open het tabblad kanaal en schakel de FITC en PE kanalen.
- De plaat in het instrument laden.
- Druk op Dot Plot en maak een nieuwe stip plot (P1). Stel voorwaarts Scatter gebied (FSC-A) versus kant Scatter-gebied (WS-A).
- Selecteer initialiseren om te beginnen met de laser en de fluidics. Druk op de ophaal om te beginnen met de overname.
- Pas de schaal om aan te tonen van de bevolking in het midden van de P1. In P1 trekken de poort "Parels" rond de gehele bevolking (met uitzondering van puin) (figuur 2A). Druk op Stop.
- Druk op Dot Plot en maak een nieuwe stip plot (P2). Stel voorwaarts Scatter-hoogte (FSC-H) versus FSC-A. Poort van de nieuwe dot plot op "Parels". In P2 tekenen van een nieuw hek rond de grotere bevolking en noem deze "ONDERHEMDEN" (figuur 2A).
Opmerking: Deze strategie is ontworpen om te voorkomen dat zo veel mogelijk de opname van kralen aggregaten in zowel de aanschaf als de analyse stappen. - Druk op Dot Plot en maken van twee verschillende dot percelen; een FITC versus SSC-A en één PE versus SSC-A. Poort van de nieuwe dot plot op "ONDERHEMDEN."
- Selecteer het aantal gebeurtenissen worden geregistreerd (bv. 20.000). Selecteer Record en start van het experiment.
6. de gegevensanalyse
- De overname-bestanden laden naar de analysesoftware.
Opmerking: De volgende stappen moeten worden toegepast op elke steekproef inclusief kralen alleen en elke onbekend monster. - Open een nieuw protocol en maken van de dot plots na dezelfde strategie beschreven in stap 5.
- Alle scatter assen op lineaire schaal en alle assen van de fluorescentie te melden schaal instellen
- De fluorescentie meetkundig gemiddelde (X-Gmean-MFI's) in de FITC en PE kanalen weergeven.
- Berekenen van de verhouding tussen X-Gbetekenen van de monsters / X-Gbetekenen van de parels gekleurd met antilichaam zonder exosome.
- Vergelijk de vouw wijzigen MFI van verschillende EV preparaten.
7. extracellulaire vesikel nummer titratie
Opmerking: Secties 7 tot en met 10 voor het instellen van het aantal deeltjes, antilichamen concentratie en specificiteit kan worden uitgevoerd, maar kan worden overgeslagen als het celtype, waaruit EV zijn afgeleid, en antilichamen blijven hetzelfde.
- Verdun deeltjes, verkregen uit stap 2.3, in 1 x PBS te verkrijgen van een aantal schorsingen variërend van 5 x 10,5 tot 2, 5 x 108 deeltjes.
- Voor elke schorsing toevoegen in een ronde onderkant-buis 1 µL van capture kraal zwembad.
- Volg het protocol vanaf stap 4.3.
8. titratie van antilichamen
Opmerking: Titratie van antilichamen wordt doorgaans uitgevoerd door een enkele antilichaam voor elke buis toe te voegen.
- Het aantal EV (totale deeltje of gehalte aan andere melkeiwitten) in alle monsters constant te houden.
Opmerking: Het juiste nummer is empirisch bepaald zoals hierboven beschreven in hoofdstuk 7. - Volg het protocol uit stappen 4.1 tot 4.5.
- Test een reeks van antilichaam concentraties boven en onder het bedrag dat door de leverancier aanbevolen. Bijvoorbeeld, voor een antilichaam met een voorgestelde concentratie van 10 µg/mL per test, test 1, 2, 5, 10, 20 en 50 µg/mL. Omvatten een monster met "parels", het toevoegen van de hoogste concentratie van antilichaam.
- Incubeer gedurende 1 uur bij 4-10 ° C.
- Voeg 100 µL van 1 x PBS voor elk monster.
- Het verwerven van de monsters.
9. de incubatietijd
- Controleer of de incubatietijd uitvoeren van overnames op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 1U, 2U en 5U).
- Volg het protocol vanaf sectie 4.
- Incubeer monsters bij 4 – 10 ° C gedurende 1 uur.
- Verwerven van monsters.
- Incubeer monsters bij 4 – 10 ° C gedurende 3 uur.
- Verwerven van monsters.
10. protocol validatie
-
EV bindende
- Voeg het bedrag van het volume dat overeenkomt met 1 x 108 deeltjes of het overeenkomstige bedrag van totaal eiwit in een ronde onderkant-buis.
- Stel het volume in op 100 µL met 1 x PBS.
- Verstoren de membraan van de EV door ultrasoonapparaat (u kunt ook een warmte schok stap kan worden toegepast) volgens de instructies van de fabrikant. Stel de frequentie en intensiteit. De periode ultrasoonapparaat empirisch kan worden vastgesteld een tijdsverloop experiment instellen (dat wil zeggen, 0 s 30 s, 1 min, 5 min, enz.).
- Voeg 1 µL van het zwembad van de kraal.
- Volg het protocol vanaf stap 4.4.
-
Antilichamenspecificiteit
- Één buis voorbereiden op elke fluorescerende-geconjugeerde IgG en het complex van kralen-EV toe te voegen, zoals beschreven in stap 4.6.
Opmerking: De fluorescerende-geconjugeerde Isotype moet overeenkomen met de IgG van het gebruikte antilichaam.
- Één buis voorbereiden op elke fluorescerende-geconjugeerde IgG en het complex van kralen-EV toe te voegen, zoals beschreven in stap 4.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totaal aantal deeltjes voor één kleuring
Aangezien een enkele kraal meer dan één deeltje binden kan, testten we verschillende voorwaarden om in te stellen van de kleinste hoeveelheid totale EV (één antilichaam per buis) tot de vroege exponentiële fase van MFI-curve. Een vaste concentratie van antilichaam werd gebruikt terwijl het totale aantal deeltjes varieerden van 5 x 10,5 tot en met 2.5 x 108. Zoals aangegeven in figuur 3A, het aantal deeltjes dat ons toelaat om te waarborgen dat het antilichaam binnen een aanvaardbaar MFI uitvoert, is het vermijden van het gebruik van een overmaat van EV, 1 x 108 deeltjes/kleuring.
Titratie van antilichamen
Wij hebben de juiste concentratie van antilichaam wat resulteert in het hoogste signaal voorkomen van de niet-specifieke antilichaam binding hebt geselecteerd. Deze test is geoptimaliseerd voor 1 x 108 deeltjes, zoals bepaald in de vorige instelling. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE en anti-CD81_PE werden getest met concentraties variërend van 1 tot 50 µg Mo/mL (figuur 3B). Anti-CD9_FITC en anti-CD63_PE antilichamen gaf een goede resolutie van signaal (7,5 en 130-fold verandering van MFI vs. kralen alleen, respectievelijk) wanneer gebruikt met concentratie van 10 µg/mL terwijl de geselecteerde concentratie voor de anti-CD81_PE antistof 5 µg/mL (465.3 vouwen was Wijzigen MFI).
Validering van methoden
Om te bevestigen dat onze methode geschikt is voor het analyseren van slechts "cup-vormige" extracellulaire blaasjes en niet membraan puin, we op de oplossing die deeltjes bevatten verschillende ultrasoonapparaat stappen, bij 10% van de amplitude, toegepast. 100 µL van 1 x PBS-oplossing met 1 x 108 deeltjes onderging verschillende ultrasoonapparaat stappen van 30 seconden tot 5 minuten en de resulterende voorbereiding met gebroken zowel goed gevormde EV werden geanalyseerd als beschreven (experimenteel protocol vanaf punt 3.3). Dientengevolge, vonden we dat 30 seconden van ultrasoonapparaat afnemen Microfinancieringsinstelling die volledig na 1 minuut werd gedumpt. Op deze timepoint is geen fluorescentie aantoonbaar voor elk van de EV-markers (figuur 3D).
Stroom cytometry karakterisering van HEK293 - en CPC-afgeleide exosomes
Deze resultaten werden gegenereerd na het protocol met de ultracentrifuge isolatie methode hierboven. De geïsoleerde exosomes zijn gekwantificeerd volgens NTA technologie en 's nachts geladen met 1 µL van gemengde parels (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). De complexe kralen + Exo werden gekleurd met de juiste hoeveelheid antilichamen anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE en anti-CD81_PE (figuur 3EF en tabel 2).
Bovendien, met behulp van de EV-CPC vergeleken we FC analyse met of zonder pre verrijking door ultracentrifugatie. Figuur 4 laat zien dat beide methoden geschikt aan profiel Exo oppervlakte markeertekens. Intensiteit van de fluorescentie verbetert pre verrijking van extracellulaire blaasjes breuk sterk met name voor CD63_PE en CD81_PE kleuring (Figuur 4 en tabel 3).
Figuur 1: Protocol en NTA percelen. (A) Schematische weergave van de experimentele protocol. (B) vertegenwoordiger NTA percelen voor Media geconditioneerd, pre Ultracentrifuge en na Ultracentrifuge stap. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: acquisitie en data analyse. (A) stroom cytometry analyse begint met het maken van een eerste poort naar de hele kralen bevolking "parels" (met uitzondering van puin) en vervolgens een tweede poort om te onderscheiden van "onderhemden" evenementen. Onderhemden zijn omheinde op een perceel met FSC-H als de x-as en FSC-A als de y-as instellen. (B-D) Representatieve dot percelen weergegeven:-shift-rechts van de intensiteit van de fluorescentie voor de positieve populaties kralen-exosomes complexen (groene, CD9 + rode CD63 +; bruine CD81 +). Isotype controle (violet) overlappen negatieve grijs gekleurde kralen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Titratie curven voor aantal deeltjes (pijlen wijzen naar de geselecteerde hoeveelheid deeltjes, 1 x 108). (A) antilichaam concentraties (pijlen wijzen naar de geselecteerde concentratie voor elk antilichaam gebruikt). (B) zowel het aantal deeltjes en antilichaam concentratie zijn perceel vs. gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI's). (C) Curve weergegeven: 3 verschillende verwerving van het preparaat met 1 – 2 h of 5 h van antilichaam-incubatie. (D) Curve weergegeven: de daling van de fluorescentie na ultrasoonapparaat op verschillende tijdstippen. (E-F) Vouw verandering (gemiddelde ± SD) van MFI voor CD9, CD63 en CD81 versus negatieve controle (kralen + antilichamen, geen EV) worden weergegeven voor HEK293 EV (n = 3 onafhankelijke replicatieonderzoeken) en voor CPC EV (n = 3 primaire cellijnen van 3 verschillende patiënten) gelieve Klik hier om een grotere versie van Dit cijfer.
Figuur 4: MFI analyse en vergelijking tussen twee procedures: directe EV-bindende met kralen (Capture kralen isolatie) en vóór verrijking met ultracentrifuge (Ultracentrifuge isolatie). Gegevens worden weergegeven als vouwen verandering (gemiddelde ± SD) van MFI voor (A) CD9, (B) CD63 en (C) CD81 vs. negatieve controle (kralen + antilichamen, geen EV). N = 3 primaire cellijnen van 3 verschillende patiënten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| CPC | CONC NTA (deel/µL) | CONC (µg/µL) |
| CPC #1 pre Ultracentrifuge | 5.02E + 06 | 2.01 |
| CPC #1 post Ultracentrifuge | 6.10E + 07 | 1.04 |
| CPC #2 pre Ultracentrifuge | 5.74E + 06 | 2.30 |
| CPC #2 post Ultracentrifuge | 7.43E + 07 | 0.79 |
| CPC #3 pre Ultracentrifuge | 2.02E + 06 | 1.90 |
| CPC #3 na Ultracentrifuge | 2.91E + 07 | 0,42 |
Tabel 1: Vergelijking tussen NTA concentratie en eiwitconcentratie voor 3 verschillende patiënt afgeleid CPC vóór en na de ultracentrifuge.
| VERANDERING VAN MFI ± SD VOUWEN | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19,17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3,72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1.87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23.18 |
Tabel 2: Waarde van vouw verandering (gemiddelde ± SD) van MFI voor HEK293 EV (n = 3 onafhankelijke replicatieonderzoeken) en CPC EV (n = 3 primaire cellijnen van 3 verschillende patiënten).
| VERANDERING VAN MFI ± SD VOUWEN | CD9 | CD63 | CD81 |
| Vastleggen van kralen isolatie | 2.96 ± 1.45 | 65.65 ± 18,87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultracentrifuge isolatie | 7.47 ± 2,71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13,38 |
Tabel 3: Waarde van verandering van de vouw van MFI (gemiddelde ± SD) voor CPC EV (n = 3 primaire cellijnen van 3 verschillende patiënten) geïsoleerd door vangen kralen of ultracentrifuge.
Tabel 4: Één productspecificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Conventionele FC techniek blijft de meest eenvoudige analytische methode te karakteriseren markeringen uitgedrukt op het oppervlak van EV. In dit verband is het meest geschikte protocol selecteren cruciaal voor het verkrijgen van nuttige informatie over individuele deeltjes breuken van belang door het vermijden van beperkingen als gevolg van gevoeligheid van het instrument. We beschreven een methode met behulp van magnetische deeltjes in combinatie met de antilichamen die Exo en kleine EV oppervlakte antigenen die geschikt voor downstream FC toepassing zijn wordt herkend. Wij gevalideerde de methode met behulp van twee verschillende soorten cellen: primaire menselijke CPC die ontstaan als een bron van grote cel voor Exo gebaseerde therapeutische benaderingen voor hart-en vaatziekten; en HEK293 cellen, een vereeuwigd cellijn vanwege betrouwbare celgroei en plasticiteit op grote schaal in onderzoek van de biologie van de cel gebruikt.
De methode kan worden toegepast op de ultracentrifuge verrijkte EV en, voor een snellere analyse ook rechtstreeks op in vitro cel-afgeleide CM met geen pre verrijking door ultracentrifugatie. De grondstof is van cruciaal belang bij het vergelijken van monsters. Toevoegen met het vastleggen van de parels rechtstreeks naar de CM zal de snelheid van de procedure, maar op hetzelfde moment verminderen intensiteit van de fluorescentie, zoals weergegeven in figuur 4A. Het is ook cruciaal voor het gebruiken van een geschikte hoeveelheid van PBS te mengen van kralen en EV tijdens de "vastleggen" stap 4.4. Wanneer u een constante incubatietijd, zal een toename van het volume verminderen intensiteit van de fluorescentie als gevolg van inefficiënte EV koppeling.
Een beperking van het protocol is dat een enkele vastleggen-kraal meerdere EV/Exo-deeltjes op het oppervlak kunt binden. Hiermee beperkt u de mogelijkheid om deelverzamelingen van EV uiten merkwaardige combinatie van antigenen met behulp van een meerdere kleuring te identificeren. De kraal gebaseerde methode levert dus semi-kwantitatieve gegevens. Met behulp van kralen uitvoering van een enkele vastleggen Ab (CD9, CD63 of CD81) kunt maximaal de karakterisatie van deeltjes die uitdrukking geven aan twee epitopen: aanwezig zijn op de parel en herkend door het vastleggen antilichaam en de ene gedetecteerd door het antilichaam dat is vervolgens toegevoegd.
De huidige gouden standaard voor Exo analyses met behulp van FC is een protocol dat is ontworpen door van der Vlist et al. in 201215. Het zorgt voor een hoge resolutie analyse van EV met behulp van een geoptimaliseerde configuratie van de verkrijgbare high-end FC (bijvoorbeeld BD instroom). Dit protocol is uiterst gedetailleerde en nuttige maar moet nog een complexe hardware-instelling met specifieke FC kalibratie vóór gebruik. Drie jaar later, Pospichalova et al.16 voorgesteld een vereenvoudigde protocol voor FC analyse van Exo met behulp van een speciale cytometer speciaal ontwikkeld voor de analyse van kleine deeltjes (b.v., Apogee A50 Micro)17. Met betrekking tot dit protocol en anderen die hebben gebruikt speciale drempel instelling11, stellen hier wij een Basisprotocol voor het uitvoeren van kleine EV fenotypering met behulp van magnetische bindende kralen die geschikt is voor conventionele FC instrumenten en vereist geen om het even welk speciale instelling. Verschillende protocollen hebben kraal gebaseerde methoden voor het karakteriseren van kleine EV gevonden in lichaamsvloeistoffen door FC12beschreven. Hier, laten we de immunocapture van de discrete subpopulatie van blaasjes positief voor CD9, CD63 en CD81 die vaak worden gebruikt als Exo markeringen18. Aldehyde-sulfaat latex19,20 en polystyreen12kralen blijven geldig alternatieven voor het binden van EV aanwezig in CM en bloedplasma vloeistof; echter, aldehyde-groepen blootgesteld aan de oppervlakte van het polymeer deeltje inschakelen koppeling van aspecifieke eiwitten en andere materialen naar de latexpartikels, waardoor het risico van besmetting door lipoproteïne of apoptotic instanties tijdens isolatie en detectie 21,22te verwerken.
Kralen gebruikt in het protocol binden alleen hele, goed gevormde EV. Wij hebben voorgesteld te verstoren EV structuur met het ultrasoonapparaat om quench het signaal (hoofdstuk 4, 'protocol validatie'). Inderdaad, één minuut van ultrasoonapparaat resulteert in verminderde fluorescentie intensiteit, waarbij wordt aangetoond dat een positief signaal kan niet worden beïnvloed door membraan puin geadsorbeerde op parels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Niets aan te geven.
Acknowledgments
L.B. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Helmut Horten Stiftung en Velux Stiftung, Zurich (Zwitserland). G.V. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Zwitserse National Science Foundation, de Cecilia-Augusta-Stichting, Lugano en de SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Zwitserland)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
