Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato
Summary
Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l’utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l’antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l’analisi di citometria a flusso a valle.
Abstract
Citometria a flusso (FC) è il metodo di scelta per misurazione semi-quantitativa dei marcatori di superficie cellulare antigene. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata per le analisi fenotipiche di vescicole extracellulari (EV) tra cui esosomi (Exo) nel sangue periferico e altri fluidi corporei. Le piccole dimensioni di EV impone l’utilizzo di strumenti dedicati, avendo una soglia di rilevamento intorno 50-100 nm. In alternativa, EV può essere associato a microsfere in lattice che possono essere rilevati da FC. Microsfere, coniugato con gli anticorpi che riconoscono EV-collegata marcatori/Cluster di differenziazione CD63, CD9 e CD81 può essere utilizzato per la cattura di EV. Exo isolato da CM possa essere analizzato con o senza pre-arricchimento di ultracentrifugazione. Questo approccio è adatto per analisi di EV utilizzando strumenti convenzionali di FC. I nostri risultati dimostrano una correlazione lineare tra i valori di intensità di fluorescenza media (MFI) e concentrazione di EV. Perturbare EV tramite sonicazione drammaticamente diminuito MFI, che indica che il metodo non rileva i detriti della membrana. Segnaliamo un metodo accurato ed affidabile per l’analisi degli antigeni di superficie EV, che può essere implementato facilmente in qualsiasi laboratorio.
Introduction
Le cellule secernono vescicole extracellulari (EV) di diverse dimensioni tra cui microvescicole (MV) ed esosomi (Exo). Quest’ultimo può essere distinto da MV da entrambe le dimensioni e il compartimento subcellulare di origine. MV (200 – 1.000 nm in dimensioni) vengono rilasciati dalle cellule del genitore versando dalla membrana del plasma. Al contrario, Exo (30 – 150 nm) provengono dalle membrane endosomal e vengono rilasciati nello spazio extracellulare quando la MVB (MVB) si fondono con la membrana cellulare1,2.
EV sono sempre più utilizzati come biomarcatori diagnostici così come, potenzialmente, strumenti terapeutici in molti campi compreso oncologia, neurologia, la cardiologia e malattie del sistema muscoloscheletrico3,4,5. Una stragrande maggioranza degli studi in corso utilizzando EV come agenti terapeutici sfruttano l’isolamento delle vescicole dal cellulare-condizionato medium (CM) di cellule coltivate in vitro. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) esercitare effetti benefici in vari contesti, e MSC-derivato EV hanno dimostrato benefici in modelli di ischemia/riperfusione miocardica lesione6 e cervello lesioni7. MSC-derivato EV inoltre esibiscono attività modulatory immuni che può essere sfruttata per trattare il rigetto immunitario, come dimostrato in un modello di malattia di terapia-refrattario graft – versus – host8. Le cellule staminali del liquido amniotiche (hAFS) attivamente arricchire CM con MVs ed Exo, eterogeneo nelle dimensioni (50 – 1.000 nm), che mediano gli effetti biologici diversi, come la proliferazione di cellule differenziate, angiogenesi, inibizione di fibrosi, e cardioprotezione4. Abbiamo recentemente dimostrato che EV e particolarmente Exo, secreta dalle cellule progenitrici derivate cardiaco umano (Exo-CPC) ridurre la dimensione di infarto del miocardio in ratti5,9.
Exo Condividi un insieme comune di proteine sulla loro superficie, tra cui tetraspannine (CD63, CD81, CD9) e complesso di istocompatibilità di classe I (MHC-I). Oltre a questo insieme comune delle proteine, Exo contengono anche proteine specifiche per il sottoinsieme di EV del tipo cella produttore. Marcatori di Exo stanno guadagnando importanza fondamentale perché giocano un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare, quindi che regolano molti processi biologici5,10. A causa delle loro piccole dimensioni, trovare un modo semplice per analizzare EV usando il classico flusso cytometry (FC) rimane un compito impegnativo.
Qui, presentiamo un protocollo semplificato per l’analisi di EV con FC, che può essere applicato a campioni pre-arricchiti ottenuti attraverso ultracentrifugazione o direttamente a CM (Figura 1). Il metodo utilizza perline rivestite con un anticorpo specifico che si lega epitopi superfici Exo-collegata canonici (CD63, CD9, CD81) senza ulteriori lavaggi. FC analisi possono essere eseguite utilizzando un citometro convenzionale senza necessità di regolazioni prima di misurazioni. Metodi per la caratterizzazione degli antigeni su singole piccole particelle utilizzando citometri a flusso sono state descritte da altri gruppi rispetto alle varie applicazioni11,12,13. Qui, abbiamo usato microsfere magnetiche funzionalizzate per la cattura di piccole particelle ed Exo, seguita da fenotipizzazione delle particelle catturate dalla FC. Anche se questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di piccole vescicole rilasciate da qualsiasi tipo di cellula in vitro, qui abbiamo fornito le condizioni di coltura delle cellule specifiche che si applicano per la coltura delle cellule progenitrici cardiache umane (CPC) e la maggior parte ambiente adatto per la produzione di EV da queste cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica convenzionale FC rimane il più semplice metodo analitico per la caratterizzazione di marcatori espressi sulla superficie di EV. A questo proposito, selezionando il protocollo più adatto è fondamentale per ottenere informazioni utili sulle frazioni delle singole particelle di interesse evitando limitazioni a causa di sensibilità dello strumento. Abbiamo descritto un metodo che utilizza particelle magnetiche accoppiate con gli anticorpi che riconoscono Exo e piccoli antigeni di superficie di EV che sono adat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. è stato sostenuto da borse di ricerca di Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurigo (Svizzera). G.V. è stato sostenuto da borse di ricerca di Swiss National Science Foundation, la Fondazione Cecilia-Augusta, Lugano e il SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Svizzera)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
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