Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름
Summary
프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.
Abstract
Cytometry (FC)는 세포 표면 항 원 표시의 반 정량적 측정에 대 한 선택의 방법입니다. 최근,이 기술은 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 말 초 혈액과 다른 체액에 extracellular 소포 (EV)의 phenotypic 분석을 위해 사용 되었습니다. EV의 작은 크기 명령 주위 검출 임계값을 갖는 전용된 기기를 사용 하 여 50-100 nm. 또는, EV FC에 의해 검출 될 수 있는 라텍스 microbeads에 바인딩할 수 있습니다. Microbeads, EV 관련 마커/클러스터 차별화 CD63, CD9, 및 CD81 인식 하는 항 체와 활용을 사용할 수 있습니다 EV 캡처. CM에서 고립 된 엑 소 ultracentrifugation에 의해 또는 사전 농축 하지 않고 분석할 수 있습니다. 이 접근은 기존의 FC 악기를 사용 하 여 EV 분석에 적합 합니다. 우리의 결과 형광 강도 의미 (MFI) 값과 EV 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 줍니다. 극적으로 쥡니다 통해 EV를 방해 MFI는 방법 막 파편을 검색 하지 않습니다 나타내는 감소. 우리 보고 어떤 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 EV 표면 항 원 분석에 대 한 정확 하 고 신뢰할 수 있는 방법.
Introduction
세포에는 세포 외 소포 (EV) microvesicles (MV) 및 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 다양 한 크기의 분 비. 후자는 구분할 수 MV에서 크기와 근원의 subcellular 구획. MV (크기에 200-1000 nm)는 부모 세포에서 원형질 막에서 흘리기에 의해 해제 됩니다. 반대로, 엑 소 (30-150 nm) endosomal 막에서 발생 하 고 세포 막1,2multivesicular 시체 (MVB) 퓨즈 때 세포 외 공간으로 해제 됩니다.
EV는 점점 사용 진단 바이오 마커 뿐만으로, 잠재적으로, 종양학, 신경학, 심장학, musculoskeletal 질환3,,45등 많은 분야에서 치료 도구. 치료제의 체 외 배양된 세포의 세포 조절 매체 (CM)에서 소포 악용으로 EV를 사용 하 여 지속적인 연구의 대다수. 여러 문맥에서 유익한 효과 발휘 하는 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 그리고 MSC 파생 EV 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해6 및 뇌 부상7모델에서 혜택 나타났습니다. MSC 파생 EV는 또한 치료-내 화 이식-비교-호스트 질병8모델에서와 같이 면역 제거 치료에 악용 될 수 있는 면역 modulatory 활동 전시. 양수 내 유체 줄기 세포 (hAFS) 적극적으로 풍요롭게 CM MVs와 엑 소, heterogeneously 배포 크기 (50-1000 nm), 차별화 된 셀, 신생 혈관, 섬유 증, 억제의 확산 등의 여러 생물학적 효과 중재 하 고 cardioprotection4. 우리 것으로 나타났습니다 최근 EV, 그리고 엑 소 특히, 인간의 심장에서 파생 된 조상 세포 (엑 소-클릭 당)에 의해 분 비 쥐5,9에서 심근 경색 크기를 감소 시키기.
엑 소 공유 tetraspanins (CD63, CD81, CD9) 등 중요 한 조직 적합성 복잡 한 그들의 표면에 단백질의 공통 된 종류 I (MHC-나). 단백질의이 공통 집합, 뿐만 아니라 엑 소 또한 프로듀서 셀 형식의 EV 하위 집합에 대 한 단백질 특정 포함 되어 있습니다. 그들은 많은 생물 학적 과정5,10를 그로 인하여 규제 간 셀룰러 통신에서 중요 한 역할 때문에 엑 소 마커 파라마운트 중요성을 얻고 있다. 그들의 소형 때문에 도전 과제 EV 클래식 흐름 cytometry (FC) 남아를 사용 하 여 분석 하는 쉬운 방법을 찾는.
여기, 우리 ultracentrifugation를 통해 미리 농축된 샘플 또는 CM (그림 1)에 직접 적용할 수 있는 FC를 사용 하 여 EV 분석에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 메서드 추가 세척 없이 정식 엑 소 관련 표면 epitopes (CD63, CD9 CD81)는 특정 항 체로 입힌 구슬을 사용 합니다. FC 분석 측정 전에 조정에 대 한 필요와 함께 기존의 cytometer를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 교류 cytometers를 사용 하 여 개별 작은 입자에 항 원 특성에 대 한 메서드는 다양 한 응용 프로그램11,,1213에 관하여 다른 그룹에 의해 기술 되었다. 여기, 우리는 작은 입자와 엑 소, FC에 의해 캡처된 입자의 형질 다음 캡처에 대 한 기능성된 자석 구슬 사용. 이 메서드는 작은 소포 생체 외에서 어떤 셀 형식에 의해 발표의 항 원 성분의 특성을 사용할 수 있습니다, 하지만 여기 우리가 제공 적용 되는 특정 세포 배양 조건을 인간의 심장 조상 세포 (CPC)의 문화를 가장 이 세포에 의해 EV 생산을 위한 적절 한 환경.
Protocol
Representative Results
Discussion
기존의 FC 기술을 마커 EV의 표면에 표현 하는 가장 간단한 분석 방법에 남아 있다. 이와 관련, 가장 적합 한 프로토콜을 선택은 악기 감도 인해 한계를 방지 하 여 개별 입자의 분수에 대 한 유용한 정보를 얻을 중요 합니다. 우리 엑 소 및 다운스트림 FC 응용 프로그램에 대 한 적당 한 작은 EV 표면 항을 인식 하는 항 체와 결합 하는 자기 입자를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리 확인 방법을 사용…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
앨라배마는 헬무트 호르 텐 재단 및 Velux 재단, 취리히 (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다. G.V. 스위스 국립 과학 재단, 세실리아-오 거 스타, 루가 노, 재단과 SHK 재단에 Herz-und Kreislaufkrankheiten (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
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