Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement
Summary
Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.
Abstract
Cytométrie en flux (FC) est la méthode de choix pour la mesure semi-quantitative des marqueurs de l’antigène de surface de la cellule. Récemment, cette technique a été utilisée pour des analyses phénotypiques des vésicules extracellulaires (EV) y compris les exosomes (Exo) dans le sang périphérique et d’autres liquides organiques. La petite taille des EV exige l’utilisation d’instruments consacrés ayant un seuil de détection autour de 50-100 nm. Par ailleurs, EV peut être lié à des microbilles de latex qui peuvent être détectées par le FC. Microbilles, conjugué avec des anticorps qui reconnaissent les EV associées aux marqueurs/Cluster de différenciation CD63 et CD9 CD81 peut être utilisé pour la capture de l’EV. Exo isolée du CM peut être analysée avec ou sans pré enrichissement par ultracentrifugation. Cette approche consiste aux analyses de EV en utilisant les instruments conventionnels de FC. Nos résultats démontrent une corrélation linéaire entre les valeurs d’intensité de Fluorescence signifie (IFM) et de la concentration de l’EV. Perturbant EV par sonication considérablement diminué MFI, indiquant que la méthode ne détecte pas de débris de la membrane. Nous rapportons une méthode précise et fiable pour l’analyse des antigènes de surface EV, qui peut être facilement implémenté dans n’importe quel laboratoire.
Introduction
Les cellules sécrètent des vésicules extracellulaires (EV) de différentes tailles, y compris des microvésicules (MV) et les exosomes (Exo). Ce dernier se distingue de MV par taille et par le compartiment subcellulaire d’origine. MV (200 – 1 000 nm de taille) sont libérés de cellules mères en projetant de la membrane plasmique. À l’inverse, Exo (30 à 150 nm) proviennent de membranes endosomale et sont libérés dans l’espace extracellulaire lorsque les corps multivésiculaires (MVB) fusionnent avec la membrane cellulaire1,2.
EV sont de plus en plus utilisés comme biomarqueurs diagnostiques ainsi que, éventuellement, des outils thérapeutiques dans de nombreux domaines, y compris l’oncologie, neurologie, cardiologie et maladies musculo-squelettiques3,4,5. Une grande majorité des études en cours à l’aide de EV comme agents thérapeutiques exploitent l’isolement des vésicules de cellule conditionnée moyen (CM) des cellules cultivées in vitro. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) exercent des effets bénéfiques dans plusieurs contextes, et dérivé de MSC EV ont montré des avantages dans les modèles d’ischémie/reperfusion myocardique blessures6 et cerveau blessure7. Dérivé de MSC EV présentent également des activités modulateurs immunitaires qui peuvent être exploitées pour traiter le rejet immunitaire, comme l’a démontré dans un modèle de réfractaires à la thérapie graft – versus – host disease8. Les cellules souches fluides amniotiques (hAFS) enrichir activement CM avec MVs et Exo, hétérogène dans la taille (50 – 1 000 nm), qui véhiculent plusieurs effets biologiques, tels que la prolifération de cellules différenciées, angiogenèse, inhibition de la fibrose, et cardioprotection4. Nous avons récemment démontré que EV et particulièrement Exo, sécrétée par les cellules progénitrices de dérivés cardiaque humaine (Exo-CPC) réduisent la taille de l’infarctus du myocarde rats5,9.
Exo partager un ensemble commun de protéines sur leur surface, y compris tetraspanins (CD63, CD81, CD9) et le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (MHC-I). En plus de cet ensemble commun de protéines, Exo contiennent également des protéines spécifiques pour le sous-ensemble de EV du type producteur. Exo marqueurs gagnent une importance primordiale car ils jouent un rôle crucial dans la communication inter cellulaire, donc réglementer de nombreux processus biologiques5,10. En raison de leur petite taille, trouver un moyen facile d’analyser les EV à l’aide de classique écoulement cytometry (FC) reste une tâche difficile.
Nous présentons ici un protocole simplifié d’analyse EV à l’aide de FC, qui peut être appliqué aux préenrichi échantillons obtenus par ultracentrifugation ou directement au CM (Figure 1). La méthode utilise des perles recouverts d’un anticorps spécifique qui lie canoniques épitopes surfaces Exo-associés (CD63, CD9, CD81) sans nouveaux lavages. FC analyses peuvent être effectuées à l’aide d’un cytomètre classique sans avoir besoin d’ajustements avant mesures. Méthodes de caractérisation des antigènes sur chaque petites particules à l’aide des cytomètres ont été décrites par d’autres groupes en ce qui concerne les diverses applications11,12,13. Ici, nous avons utilisé des billes magnétiques pour la capture de petites particules et Exo, suivie de phénotypage des particules capturées par le FC. Bien que cette méthode peut être utilisée pour caractériser la composition antigénique de petites vésicules publié par n’importe quel type de cellules in vitro, nous avons fourni ici les conditions de culture de cellules spécifiques qui s’appliquent pour la culture des progéniteurs cardiaques humaines (CPC) et le plus environnement approprié pour la production de EV par ces cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technique classique de FC reste la plus simple méthode analytique pour caractériser des marqueurs exprimés à la surface de l’EV. À cet égard, sélectionner le protocole plus approprié est essentiel pour obtenir des informations utiles sur des fractions de particules individuelles d’intérêt en évitant les limites en raison de la sensibilité de l’instrument. Nous avons décrit une méthode qui utilise des particules magnétiques, couplés avec des anticorps qui reconnaissent les Exo et les antigènes de su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. a bénéficié de subventions de recherche de Helmut Horten Stiftung et Velux Stiftung, Zurich (Suisse). G.V. a été soutenue par des subventions de recherche de Swiss National Science Foundation, la Fondation Cecilia-Augusta, Lugano et la SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suisse)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
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