Summary
Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.
Abstract
Akış Sitometresi (FC) hücre yüzey antijeni işaretlerinin yarı kantitatif ölçüm için seçim yöntemidir. Son zamanlarda, bu teknik ekstraselüler veziküller (EV) exosomes (dış) periferik kan ve diğer vücut sıvıları da dahil olmak üzere fenotipik analizleri için kullanılmıştır. EV küçük boyutlu bir algılama eşiği çevresinde sahip özel aletlerin kullanımı zorunlu kılar 50-100 nm. Alternatif olarak, EV FC tarafından tespit edilebilir lateks lastikteki ilişkili olabilir. Lastikteki EV ilişkili işaretçileri/küme farklılaşma CD63, CD9 ve CD81 tanımak antikorlar ile Birleşik,-ebilmek var olmak kullanılmış EV yakalama için. Exo CM izole veya ön zenginleştirme olmadan ultrasantrifüj tarafından çözümlenebilir. Geleneksel FC aletler kullanarak EV analizleri için uygun bir yaklaşımdır. Bizim sonuçlar demek floresan yoğunluğu (MFI) değerleri ve EV konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki gösterilmektedir. EV sonication önemli ölçüde bozmakta MFI, yöntemi membran enkaz algılamaz gösteren azalmıştır. Biz herhangi bir laboratuvarda olabilir uygulamaya kolayca EV yüzey antijenleri analizi için doğru ve güvenilir bir yöntem raporu.
Introduction
Hücreleri ekstrasellüler veziküller (EV) microvesicles (MV) ve exosomes (dış) dahil olmak üzere farklı boyutlardaki salgılar. İkinci MV boyutu ve menşe hücre altı yuvası tarafından ayrılır. MV (200-1000 nm boyutunda) plazma zarı dökülme tarafından üst hücrelerden salınır. Tersine, Exo (30-150 nm) ve endosomal membran köken multivesicular organları (MVB) ile hücre zarının1,2sigorta ekstraselüler uzaya serbest bırakılır.
EV vardır giderek tanılama biyolojik de gibi büyük olasılıkla, Onkoloji, Nöroloji, Kardiyoloji ve kas-iskelet hastalıkları3,4,5de dahil olmak üzere birçok alanlarda tedavi aletleri used. Devam eden çalışmalar terapötik ajanlar veziküller ortamdan hücre şartına (CM) tüp bebek kültürlü hücre izolasyon yararlanma gibi EV kullanarak büyük bir çoğunluğu. Mezenkimal kök hücre (MSCs) çeşitli bağlamlarda yararlı etkileri uygulamak ve MSC kaynaklı EV miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarı6 ve beyin hasarı7modellerinde faydalar göstermiştir. MSC kaynaklı EV ayrıca bağışıklık ret, tedavi etmek için bir terapi-refrakter graft - versus - host hastalığı8modelinde gösterildiği şekilde yararlanılabilir immün düzenleyici faaliyetleri sergi. Amniyotik sıvı kök hücreleri (hAFS) aktif CM MVs ve Exo heterogeneously boyutu (50-1000 nm), hangi hızla çoğalmak-in farklılaşmış hücreler, anjiogenez, fibrozis, inhibisyonu gibi birçok biyolojik etkileri arabuluculuk dağıtılmış, zenginleştirmek ve cardioprotection4. Biz son zamanlarda göstermiştir EV ve özellikle Exo (Exo-TBM) insan kalp kaynaklı progenitör hücreler tarafından salgılanan, fareler5,9miyokard enfarktüsü boyutunu küçültün.
Exo paylaşım proteinler onların yüzeyinde, tetraspanins (CD63, CD81, CD9) ve MHC kompleksi de dahil olmak üzere ortak bir dizi sınıf ı (MHC-ben). Proteinler bu ortak kümesinin yanı sıra, Exo da proteinler özel EV alt yapımcı hücre türü için içerir. Onlar arası hücresel iletişim, böylece birçok biyolojik süreçlerin5,10düzenleyen çok önemli bir rol oynamak çünkü Exo işaretleri büyük önem kazanmaktadır. Küçük boyutlarından dolayı zor bir görev EV klasik akış sitometresi (FC) kalıntıları kullanarak analiz etmek için kolay bir yol bulmak.
Burada, önceden zenginleştirilmiş örnekleri ultrasantrifüj ile elde edilen veya doğrudan CM (Şekil 1) uygulanabilir FC EV analizi için basitleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem kurallı Exo ilişkili yüzey epitopları (CD63, CD9, CD81) bağlar spesifik bir antikor ile kaplı boncuk ek yıkama kullanır. FC analizleri ayarlamalar ölçümleri öncesinde gerek yok ile geleneksel sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Akış cytometers kullanarak bireysel küçük parçacıklar antijenlere karakterizasyonu için yöntemleri diğer gruplar ile ilgili çeşitli uygulamalar11,12,13tarafından tarif edilmiştir. Burada, functionalized manyetik boncuklar küçük parçacıklar ve Exo FC tarafından yakalanan parçacıkların fenotipleme ardından, yakalanması için kullanılır. Her ne kadar küçük veziküller herhangi bir hücre tipi tüp bebek tarafından yayımlanan antijenik kompozisyon tanımlamak için bu yöntem kullanılabilir, burada geçerli olan belirli hücre kültür koşulları kültür insan kalp progenitör hücre (TBM) ve en iyi için verdiğimiz Bu hücreler tarafından EV imalatı için uygun ortam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. toplama ve klimalı ortam işleme
- 55 cm2 Petri yemekler PBS içinde %0.02 domuz deri jelatin ile kat.
- Plaka TBM (8.000/cm2) önceden kaplanmış yemekler 7 mL, Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (20 ile desteklenmiş IMDM) ile % FBS (Fetal sığır Serum) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S).
Not: "TBM" olmuştur insan explant türetilmiş hücrelere bir terimdir başka bir14bölümünde. CM farklı hücre türleri belirli koşullarda kültürlü toplanabilir. Eldiven giymek ve biyolojik bir başlık altında çalışır. - Sonra hücreleri hakkında ulaşmak % 80 izdiham, kültür orta kaldırmak, hücreleri iki kez ile Dulbecco'nın PBS (PBS) Ca ve Mg-içermeyen yıkama ve eski yerine koymak o ile 10 mL serum-Alerjik Exo-üretim orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta [DMEM] yüksek glikoz, 4,5 g/mL).
Not: Yavaş yavaş serum bırakma durumu (SF) hücrelere uyarlamak için kültür orta, serum konsantrasyonu, ilerici bir düşüş devam. Serum-Alerjik ortamına duyarlı hücreler için FBS içeren ama EV tükenmiş bir ortam hazırlayın. Tüm besinleri ile artı % 10-%20 (v/v) FBS takıma orta hazırlayın. Gecede 100.000 × g, 4 ° c orta santrifüj kapasitesi Bu yordamı FBS kaynaklı EV kaldırılması % 100 garanti etmez unutmayın. - 7 gün sonra CM Polipropilen santrifüj tüpler toplamak.
Not: Orta Klima süre hücre türüne göre değişir. Serum-Alerjik ortamına duyarlı hücreler için orta ilk hacmi artırın ve 24-48 h CM koleksiyonuna süre azaltın. - CM 4-10 ° C'de 20 dk 3000 x g , santrifüj hücre enkazı temizleyin Süpernatant 100 kDa santrifüj filtre tüp içinde toplamak.
- Konsantre CM tüp 2.000 x g 4-10 ° C'de 20 dk için de iplik tarafından temizlendi
Not: Bu adım CM yüksek hızlı santrifüj adımlar için küçük hacimli tüpler kullanımına izin veren ilk hacmi azaltır ve küçük protein toplamları ortadan kaldırmak için katkıda bulunacaktır. - Microcentrifuge tüp içinde konsantre toplamak. 4-10 ° C'de 15 dakika 10.000 x g , santrifüj
- Süpernatant toplamak ve Bölüm 2 (EV zenginleştirme) devam edin. Bir ultracentrifuge yoksa doğrudan Bölüm 3 (nanopartikül izleme analizi (NTA) miktar) devam etmek.
Not: EV kesir ön zenginleştirme son okuma floresan yoğunluğu (bkz: temsilcisi sonuçları ve Şekil 4) artırır. Temizlenen CM (1,8 noktadan) 4 ° C'de artık sonra 1-2 gün boyunca saklanabilir veya alternatif olarak −80 ° C için birkaç ay. 5 CM eksozom ölçekli enkaz donma-çözülme sürecine biçimi değil emin olmak için önce depolama-80 ° C'de hücresel herhangi bir enkaz kaldırmak için önceden temizlenmiş olmalıdır.
2. hücre dışı veziküller zenginleştirme tarafından Ultracentrifuge (isteğe bağlı)
- Adım 1.8 süpernatant bir polikarbonat kalın duvar ultracentrifuge tüpü yerleştirin. Maksimum kapasite (3.2 mL) ulaşıncaya kadar tüp 1 fosfat tampon serum (PBS) x ile doldurun.
- Bir titanyum sabit açılı rotor (8 x 3.2 mL, k-faktör 13) örnekleri yükleyin. Masa üstü ultracentrifuge rotor yükleyin. 100.000 x g 4-10 ° C'de 3 h için de ultracentrifuge
- Süpernatant atın ve pelet 1 x PBS 100 µL içinde resuspend.
3. nanopartikül izleme analizi (NTA) miktar
- 1 x PBS 999 µL (üzerinden her iki adım 2.3 ya da 1.8) örnek 1 µL sulandırmak. Kabarcık oluşumu kaçınarak bir 1 mL şırınga örnek yükleyin. Şırınga muayene odasının giriş limanında yük.
- Üzerine lazer açın. Kamera ile yakalama düğmesini açın. Odağı ayarlayın.
- 60 en az 3 farklı kare kayıt her s.
- Yazılımda bulunan Toplu işleme seçeneği 3 farklı satın alma analiz.
Not: NTA teknoloji mevcut değildir, bir protein miktar tarafından Bradford tahlil gerçekleştirin (1 x 108 parçacıklar karşılık gelen 1-2 µg ultrasantrifüj sonra toplam protein veya 50 – 60 µg toplam protein miktar CM için doğrudan gerçekleştirilirse Bu proteinler kirletici EV--dan farklı içerir; bakınız Tablo 1)5.
4. numune hazırlama
- Yakalama boncuk 3 tip bir havuz hazırlamak (CD9 boncuk, CD63 boncuk ve CD81 boncuk bir 1:1:1 oran; bkz: Malzemeler tablo) ve girdap.
Not: Havuzun 1 ay boyunca istikrarlı olması için test edilmiştir. Boncuk yakalayan tek bir tür kullanılabilir, bu EV alt nüfus tespiti boncuk havuzlu discriminable izin verir. Tek antijen boncuk yakalamayı kullanarak, o-ecek var olmak olası çağdaş için tetraspanin proteinler, CD9, CD81 veya CD63, gibi varlığını gösteren ve faiz antijen tespit tarafından floresan antikor. Alternatif aldehit-sülfat lateks boncuk da ticari olarak kullanılabilir. Bu boncuklar hidrofobik yüzey adsorpsiyon MV ve EV için mevcut. - Bir yuvarlak alt tüp hacmi 1 x 108 parçacıklar artı 1 µL karşılık gelen 1.2 x (her test için) toplam 105 boncuk boncuk havuzun karşılık gelen miktarda ekleyin.
- Boncuk negatif kontrol, bu vesileyle "Boncuk" anılacaktır olarak görev yapacak EV olmadan 1 µL içeren bir tüp hazırlayın.
- 1 x PBS ile 100 µL için ses düzeyini ayarlayın. Bir termo-karıştırıcı tüpü yerleştirin ve gecede 4-10 ° C'de 400 rpm sallamak
- Ertesi gün, örnekleri yuvarlak alt 96-şey plaka (veya FC tüpler) taşıyın.
- Antikor (10 µg/mL CD9_FITC, CD63_PE 10 µg/mL ve 5 µg/mL CD81_PE) ekleyin.
- 4-10 ° C'de 1 h kuluçkaya
- 1 x PBS 100 µL her şey için ekleyin.
- Alım için devam edin.
5. satın alma
- Satın alma yazılımını açın ve enstrüman kadar başlar (sitometresi > Sistem başlangıç programı). Yeni bir deneme açın.
- Deneysel bir şablon oluşturduğunuzu, ardından plaka ve Plaka Ekleseçeneklerini belirleyin. Plaka üzerinde örnekleri konumunu seçin ve Ayarla olarak örnek debasın.
- Örnek adı (yani TBM #1_CD9FITC) Adlandırma kurallarıgirin. Kanal sekmesini açın ve FITC ve PE kanalları geçin.
- Araç plaka yükleyin.
- Nokta Arsa tuşuna basın ve yeni bir nokta çizim (P1) oluşturma. İleri dağılım alanı (FSC-A) (SSC-A) karşı tarafı dağılım alanı belirleyin.
- Lazer ve akışkanlar başlatmak için Başlat seçin. Basın Al satın başlatmak için.
- Nüfus P1 ortasında göstermek için ölçek ayarlamak. P1 içinde "Boncuk" gate (enkaz hariç) tüm popülasyon etrafında çizmek (Şekil 2A). Durtuşuna basın.
- Nokta Arsa tuşuna basın ve yeni bir nokta çizim (P2) oluşturma. Dağılım-yükseklik (FSC-H) FSC-A. karşı ileri ayarla Yeni nokta arsa üzerinde "Boncuk" kapı P2 daha büyük nüfus çevresinde yeni bir kapı çizin ve "Gömlek" (Şekil 2A) adı.
Not: Bu strateji kadar toplama ve Analizi adımları boncuk toplamları mümkün olduğunca dahil önlemek için tasarlanmıştır. - Nokta çizmek basın ve iki farklı nokta araziler oluştur; SSC-A karşı bir FITC ve SSC-A. karşı bir PE "Gömlek." yeni nokta Arsa kapısı
- Olayları kaydetmek için (örneğin, 20.000) sayısını seçin. Kaydı seçin ve deneme başlayın.
6. veri analizi
- Satın alma dosyaları analiz yazılımı yükleyin.
Not: Aşağıdaki adımları yalnızca boncuk ve bilinmeyen her örnek de dahil olmak üzere her örnek için uygulanması gerekiyor. - Yeni bir iletişim kuralı açın ve adım 5'te açıklanan aynı stratejiyi takip nokta araziler oluşturun.
- Tüm dağılım eksenleri için doğrusal ölçek ve ölçek oturum için tüm floresans eksenler ayarlayın.
- Floresans geometrik ortalama (X-Gmean-MFI) FITC ve PE kanalları göster.
- X-Gdemek örneklerin oranını hesaplamak / X-Gdemek boncuk lekeli ile antikor eksozom olmadan.
- Kat değiştirme MFI farklı EV hazırlıkları karşılaştırın.
7. ekstraselüler vezikül numara titrasyon
Not: Bölüm 7-10 parçacıklar, antikorlar konsantrasyon ve özgüllük numarası ayarlamak için yapılabilir ama eğer-ebilmek var olmak kaptan hücre tipi, hangi EV türetilmiş ve antikorlar aynı kalır.
- Parçacıklar, süspansiyonlar 5 x 105 2.5 x 108 parçacıklar arasında değişen bir dizi elde etmek için 1 x PBS 2.3, adımda elde edilen sulandırmak.
- Her süspansiyon için yuvarlak alt tüpte 1 µL yakalama boncuk havuzu ekleyin.
- Protokol 4.3 adımından izleyin.
8. antikor titrasyonu
Not: Antikor titrasyonu genellikle her tüp için tek bir antikor ekleyerek yapılır.
- EV (Toplam parçacık veya protein içeriği) sayısı tüm örneklerinde sabit tutmak.
Not: Uygun ampirik olarak yukarıda 7 bölümünde açıklandığı gibi belirlenir. - Protokolü 4.1 4.5 adımları izleyin.
- Antikor konsantrasyonları yukarıdaki ve tedarikçi tarafından önerilen miktarın altında bir dizi test. Örneğin, 10 µg/mL test başına önerilen bir konsantrasyon ile bir antikor için 1, 2, 5, 10, 20 ve 50 µg/mL test. Bir örnek ile "sadece boncuklar", antikor en yoğun ekleme içerir.
- 4-10 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- 1 x PBS her örnek için 100 µL ekleyin.
- Örnekleri edinin.
9. kuluçka süresi
- Satın almalar farklı zaman noktalarda (örneğin, 1 h, 2 h ve 5 h) gerçekleştirme kuluçka süresi doğrulayın.
- 4 bölümünden başlayarak Protokolü izleyin.
- 4-10 ° C'de örnekleri 1 h için kuluçkaya.
- Örnekleri edinin.
- 4-10 ° C'de örnekleri 3 h için kuluçkaya.
- Örnekleri edinin.
10. iletişim kuralı doğrulama
-
EV bağlama
- Bir yuvarlak alt tüp hacmi 1 x 108 parçacıkları veya karşılık gelen tutarı toplam protein karşılık gelen miktarda ekleyin.
- 1 x PBS ile 100 µL için ses düzeyini ayarlayın.
- EV membran tarafından bozabilir (alternatif olarak bir ısı şok adım uygulanabilir) sonication üreticinin yönergelerine uygun. Sıklığı ve şiddeti ayarlayın. Sonication dönemi ampirik bir zaman ders deneme kurulabilir (yani, 0 s, 30 s, 1 dk, 5 dk, vs.).
- 1 µL boncuk havuzu ekleyin.
- 4.4 adımından başlangıç iletişim kuralı izleyin.
-
Antikor özgüllük
- Bir tüp her fluorochrome Birleşik IgG için hazırlamak ve karmaşık boncuk-ev 4.6. adımda açıklandığı gibi ekleyin.
Not: Fluorochrome-Birleşik izotip kullanılan antikor IgG ile aynı olmalıdır.
- Bir tüp her fluorochrome Birleşik IgG için hazırlamak ve karmaşık boncuk-ev 4.6. adımda açıklandığı gibi ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek boyama için parçacıklarının toplam sayısı
Tek bir boncuk birden çok parçacık bağlayabilirsiniz, biz erken üssel faz MFI eğrinin ulaşmak için toplam EV (tüp başına tek antikor) en az miktarda ayarlamak için farklı koşullarda test. 5 x 105 2.5 x 10 için değişen parçacıklar toplam sayısı ise antikor sabit bir konsantrasyon kullanılan8. Şekil 3A, antikor kabul edilebilir bir MFI içinde gerçekleştirir emin olmak için bize izin verir parçacıkları sayısı gösterildiği gibi EV, aşırı kullanımı kaçınarak 1 x 108 parçacıklar/boyama olduğunu.
Antikor titrasyonu
Biz en yüksek sinyalin nonspesifik antikor bağlama önleme kaynaklanan antikor uygun konsantrasyonu seçildi. Bu test için 1 x 108 parçacıkları, önceki ayarında belirlendiği gibi optimize edilmiştir. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE ve anti-CD81_PE 1-50 µg/mL (Şekil 3B) arasında konsantrasyonları ile test edildi. Anti-CD9_FITC ve anti-CD63_PE antikorları verdi iyi sinyal çözünürlüğe (MFI 7.5 ve 130-fold değişikliği boncuk yalnız, sırasıyla) anti-CD81_PE antikor 5 µg/mL (465.3 kat için seçili toplama sırasında 10 µg/mL konsantrasyonu, kullanıldığında Değiştir MFI).
Yöntemi doğrulama
Bizim Yöntem yalnızca "Kupası şeklindeki" hücre dışı veziküller ve membran enkaz çözümlemek uygun olduğunu onaylamak için biz farklı sonication adımları, genlik, yüzde 10'u parçacıkları içeren çözüm uygulanır. 1 x 1 x 108 parçacıkları içeren PBS çözüm 100 µL 5 dakika 30 saniye farklı sonication adımlar uygulandı ve kırık ve iyi şekilli EV içeren elde edilen hazırlık noktadan açıklanan (Deneysel iletişim kuralı olarak analiz edilebilir 3.3). sonication 30 saniye 1 dakika sonra tamamen atılmış MFI azaltmak sonucu olarak bulduk. Bu timepoint hiçbir floresans herhangi bir EV işaretleri (şekil 3D) için algılanabilir.
Akış Sitometresi karakterizasyonu HEK293 ve TBM türetilen exosomes
Bu sonuçlar ultracentrifuge izolasyon yöntemiyle yukarıda sunulan protokol sonrası oluşturulan. İzole exosomes NTA teknolojisi ile sayısal ve gecede karışık boncuk 1 µL ile yüklenen (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 anti-CD81 x). Karmaşık boncuk + Exo antikor anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE ve anti-CD81_PE (Şekil 3EF ve Tablo 2) uygun miktar ile lekeli.
Ayrıca, EV-TBM kullanarak biz FC analiz veya ön zenginleştirme olmadan ultrasantrifüj tarafından göre. Şekil 4 her iki yöntem profil Exo yüzey işaretleri için uygun olduğunu göstermektedir. Hücre dışı veziküller kesir ön zenginleştirme, özellikle CD63_PE ve CD81_PE boyama (Şekil 4 ve Tablo 3) Floresan yoğunluğu büyük ölçüde geliştirir.
Şekil 1: Protokolü ve NTA çizer. (A)Deneysel protokol şematik gösterimi. (B) temsilcisi NTA şartına medya, ön Ultracentrifuge ve sonrası Ultracentrifuge adım için çizer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: satın alma ve veri analizi. (A)Akış Sitometresi Analizi başlar ilk kapısı bütün oluşturma ile "(enkaz hariç) boncuk" nüfus boncuk ve daha sonra ikinci bir kapı "gömlek" olayları ayırt etmek için. Gömlek FSC-H x ekseni olarak ve FSC-A y ekseni olarak ayarlandığı bir arsa üzerinde kapı. (B-D) Sağ-shift floresans yoğunluk boncuk-exosomes kompleksleri (yeşil, CD9 +; kırmızı CD63 +; kahverengi CD81 +) pozitif nüfus için gösterilen temsilcisi nokta araziler. İzotip kontrol (menekşe) üst üste negatif gri renkli boncuklar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Titrasyon eğrileri (okları göster seçili miktarını parçacıklar, 1 x 108) parçacıkları sayısı için. (A)antikor konsantrasyonları (okları göster seçili toplama her antikor kullanılan için). (B) parçacıklar ve antikor sayısı hem de konsantrasyon Arsa ortalama floresans yoğunluğu (MFI) vs vardır. (C) eğrisi hazırlık 1-2 h ile 3 farklı satın alma veya 5 h, antikor kuluçka gösterilen. (D) eğrisi sonication farklı zaman noktalarda takip floresans azalma gösteren. (E-F) Değişikliği (ortalama ± SD) MFI negatif kontrol (boncuk + antikorlar, hiçbir EV) HEK293 EV için gösterilen CD9, CD63 ve CD81 rakip için katlama (n = 3 bağımsız çoğaltır) ve TBM EV için (n = 3 farklı hasta 3 birincil hücre satırlarından) lütfen tıklayınız daha büyük bir sürümünü görüntülemek için Bu rakam.
Şekil 4: MFI Analizi ve iki prosedür arasındaki karşılaştırma: boncuk (yakalama boncuk yalıtım) ve ultracentrifuge (Ultracentrifuge yalıtım) ile ön zenginleştirme ile EV-bağlama doğrudan. Veri değişikliği (ortalama ± SD) MFI(a)CD9, (B) CD63 ve (C) CD81 negatif kontrol (boncuk + antikorlar, hiçbir EV) vs için kat olarak gösterilir. N = 3 farklı hasta 3 birincil hücre satırlarından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| TBM | Konsantrasyon NTA (Bölüm/µL) | Konsantrasyon (µg/µL) |
| TBM #1 öncesi Ultracentrifuge | 5.02E + 06 | 2,01 |
| TBM #1 sonrası Ultracentrifuge | 6.10E + 07 | 1,04 |
| TBM #2 ön Ultracentrifuge | 5.74E + 06 | 2.30 |
| TBM #2 sonrası Ultracentrifuge | 7.43E + 07 | 0,79 |
| TBM #3 ön Ultracentrifuge | 2.02E + 06 | 1.90 |
| TBM #3 sonrası Ultracentrifuge | 2.91E + 07 | 0,42 |
Tablo 1: NTA konsantrasyon ve 3 farklı hasta için protein konsantrasyonu arasında karşılaştırma önce ve ultracentrifuge sonra TBM türetilmiş.
| DEĞİŞİKLİK MFI ± SD KAT | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| TBM #1 | 14,15 ± 3,72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| TBM #2 | 15.76 ± 1,87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| TBM #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23,18 |
Tablo 2: Değer için HEK293 EV kat değişim (ortalama ± SD) MFI (n = 3 bağımsız çoğaltır) ve TBM EV (n = 3 farklı hasta 3 birincil hücre satırlarından).
| DEĞİŞİKLİK MFI ± SD KAT | CD9 | CD63 | CD81 |
| Boncuk yalıtım yakalama | 2.96 ± 1,45 | 65.65 ± 18.87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultracentrifuge yalıtım | 7,47 ± 2.71 | 236.00 ± 25,06 | 65.05 ± 13,38 |
Tablo 3: Değer MFI (ortalama ± SD) kat değişim TBM EV için (n = 3 farklı hasta 3 birincil hücre satırlarından) yakalama boncuk veya ultracentrifuge tarafından izole.
Tablo 4: Tek ürün özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel FC teknik EV yüzeyine ifade işaretçileri özelleştirmek için en kolay analitik yöntem kalır. Bu bağlamda, en uygun iletişim kuralını seçme sınırlamaları enstrüman duyarlılık nedeniyle kaçınarak bireysel parçacık kesirler ilgi yararlı bilgiler elde etmek çok önemlidir. Manyetik parçacıklar Exo ve aşağı akım FC uygulama için uygun olan küçük EV yüzey antijenleri tanır antikorlar ile birleştiğinde kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Biz iki farklı hücre türleri'ni kullanma yöntemi doğrulanmış: kalp hastalığı için; tedavi yaklaşımları Exo tabanlı için büyük hücre kaynağı olarak ortaya çıkmakta birincil insan TBM ve HEK293 hücreleri, hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir hücre büyümesi ve plastisite nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir ölümsüzleştirdi hücre satırı.
Bu yöntem ultracentrifuge zenginleştirilmiş EV için uygulanabilir ve daha hızlı analiz için Ayrıca doğrudan tüp bebek üzerinde hücre CM ile hiçbir ön zenginleştirme ultrasantrifüj tarafından kaynaklı. Başlangıç materyali örnekleri karşılaştırırken önemlidir. Şekil 4Agörüldüğü gibi azaltmak floresan yoğunluğu, boncuk doğrudan CM için yakalama hız prosedür ama aynı zamanda ekleme. Boncuk ve EV "yakalama" adımında 4.4 karıştırmak için PBS uygun bir miktarda kullanmak önemlidir. Sürekli kuluçka vakit kullanırken, bir artan hacmi floresan yoğunluğu nedeniyle verimsiz EV kaplin azalacak.
Bir iletişim kuralının bir tek yakalama boncuk yüzeyi üzerinde birden fazla EV/Exo parçacıkları bağlayabilirsiniz kısıtlamadır. Bu tuhaf bir birden çok boyama kullanarak antijenleri kombinasyonu ifade EV kümelerine belirlenmesi olasılığını sınırlar. Boncuk tabanlı yöntemi bu nedenle yarı nicel veri verir. Bir tek yakalama Ab (CD9, CD63 veya CD81) taşıyan boncuk kullanarak iki epitopları hızlı parçacıklar karakterizasyonu en yüksek seviyede izin verir: bir boncuk üzerinde present ve yakalama antikor tarafından tanınan ve bir tespit mi antikor tarafından sonradan eklendi.
FC kullanarak Exo analizleri için geçerli altın standart 201215dakika içinde van der Vlist vd tarafından geliştirilen bir protokoldür. Piyasada bulunan üst düzey FC (örneğin, BD akını) en iyi duruma getirilmiş bir yapılandırmayla EV yüksek çözünürlüklü bir analiz için izin verir. Bu iletişim kuralı son derece detaylı ve yararlı ama hala karmaşık donanım ayarların belirli FC kalibrasyon kullanmadan önce gerekli. Üç yıl sonra Pospichalova ve ark.16 küçük parçacıklar (örneğin, Apogee A50 mikro)17analizi için özel olarak geliştirilen bir adanmış sitometresi kullanarak Exo FC çözümlenmesi için basitleştirilmiş bir protokol önerdi. Bu iletişim kuralı ve diğer özel eşik ayarı11-si olmak kullanılmış ile ilgili olarak, geleneksel FC aletleri için uygundur ve does değil istemek birisi Manyetik bağlama boncuk kullanarak küçük EV fenotipleme gerçekleştirmek için temel bir protokol burada evlenme teklif özel ayar. Farklı protokolleri boncuk tabanlı yöntemleri FC12ile vücut sıvısının içinde bulunan küçük EV karakterize anlatmıştık. İşte, veziküller, ayrı alt nüfus immunocapture CD9, CD63 ve Exo işaretleri18yaygın olarak kullanılan CD81 olumlu göstermektedir. Aldehit-sülfat lateks19,20 ve polistiren12boncuk ev CM ve kan plazma sıvı mevcut bağlama için geçerli alternatifler kalır; Ancak, polimer partikül yüzeyine maruz aldehid gruplar kancası belirsiz proteinlerin ve diğer malzemeler için lateks parçacıkları, yalıtım ve algılama sırasında bulaşma riskini lipoprotein veya apoptotik kurumlar tarafından böylece artan sağlar 21,22işlemek.
Boncuk iletişim kuralında kullanılan yalnızca tüm, iyi şekilli EV bağlayın. Sinyal (Bölüm 4, "iletişim kuralı doğrulama") gidermek için sonication tarafından EV yapısı bozmaya evlenme teklif etti. Gerçekten de, bir dakika azalmış floresan yoğunluğu, böylece olumlu bir sinyal üstündeki adsorbe membran enkaz tarafından etkilenen olamaz gösterilen sonication sonuçlarının.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bildirmek için bir şey yok.
Acknowledgments
BANGİN'Helmut Horten Stiftung ve Velux Stiftung, Zürih (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. G.V. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, Cecilia-Augusta Vakfı, Lugano ve SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
