Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Summary

Een protocol voor het voorbereiden van ¹³C,¹⁵N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Abstract

Dit protocol laat zien hoe uniform ¹³C, ¹⁵N-geëtiketteerden schimmel materialen kunnen worden geproduceerd en hoe deze zachte materialen moeten worden voorafgegaan voor Solid state NMR en gevoeligheid-enhanced DNP experimenten. De monster veredeling van plantaardige biomassa is ook gedetailleerd. Met deze methode kan de meting van een reeks van 1D en 2D ¹³C –¹³C /¹⁵N correlaties spectra, waarmee de hoge resolutie structurele opheldering van complexe biomaterialen in hun oorspronkelijke staat, met minimale verstoring. De isotoop-labeling kan door het kwantificeren van de intensiteit in 1D spectra en het spuitrendement polarisatie in 2D correlatie spectra worden onderzocht. Het succes van de bereiding van de monsters van de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) kan worden geëvalueerd door de factor van de verhoging van de gevoeligheid. Verdere experimenten onderzoeken de structurele aspecten van de polysacchariden en eiwitten zal leiden tot een model van de driedimensionale architectuur. Deze methoden kunnen worden gewijzigd en aangepast om te onderzoeken van een breed scala van koolhydraat-rijke materialen, met inbegrip van de natuurlijke celwanden van planten, schimmels, algen en bacteriën, evenals gesynthetiseerd of ontworpen koolhydraten polymeren en hun complex met andere moleculen.

Introduction

Koolhydraten spelen een centrale rol in verschillende biologische processen zoals energieopslag, structurele gebouw, en cellulaire erkenning en hechting. Ze zijn verrijkt in de celwand, die is een fundamentele component in planten, schimmels, algen en bacteriën^1,2,3. De celwand fungeert als een centrale bron voor de productie van biobrandstof en biomaterialen, evenals een veelbelovende doelgroep voor antimicrobiële therapie^{4,5,6,7,8 , 9}.

Het moderne begrip van deze complexe materialen heeft aanzienlijk door decennia van inspanningen die werden gewijd aan de structurele karakterisering met behulp van vier belangrijke biochemische of genetische methoden naar voren geschoven. De eerste belangrijke methode berust op opeenvolgende behandelingen met behulp van agressieve chemicaliën of enzymen te breken de celwanden in verschillende delen, die wordt gevolgd door de samenstelling en analyse van de koppeling van suikers in elke fractie¹⁰. Deze methode werpt licht op het domein distributie van polymeren kan, maar de interpretatie misleidend zijn als gevolg van de chemische en fysische eigenschappen van biomoleculen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk om te bepalen of de alkali-extraheerbare fractie afkomstig uit één domein van minder strak gestructureerde moleculen of ruimtelijk gescheiden moleculen met vergelijkbare oplosbaarheid is. Ten tweede, de uitgepakte gedeelten of hele celwanden kan ook worden gemeten met behulp van oplossing NMR om te bepalen van de covalente verbanden, ook aangeduid als crosslinking, tussen verschillende moleculen^{11,12,13, 14,15}. Op deze manier de gedetailleerde structuur van covalente ankers gesondeerd kon worden, maar beperkingen kunnen bestaan als gevolg van de lage oplosbaarheid van polysacchariden, het relatief kleine aantal crosslinking sites en de onwetendheid van de niet-covalente effecten die stabiliseert polysaccharide verpakking, met inbegrip van de waterstof-bonding, van der Waals force, elektrostatische interactie en polymeer entanglement. Ten derde, de bindende affiniteit is vastbesloten in vitro met behulp van geïsoleerde polysacchariden^16,17,18,19, maar de reiniging procedures kunnen ingrijpend wordt gewijzigd de structuur en eigenschappen van deze biomoleculen. Deze methode mislukt ook de geavanceerde afzetting en assemblage van macromoleculen na biosynthese wilt repliceren. Ten slotte het fenotype, cel morfologie en mechanische eigenschappen van genetische mutanten met verzwakte productie van bepaalde celwand component werpen licht op de structurele functies van polysacchariden, maar meer moleculaire bewijs is nodig om deze brug macroscopische waarnemingen met de gemodificeerde functie van eiwit machineries²⁰.

Recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van de multidimensionale Solid state NMR spectroscopie hebben ingevoerd een unieke gelegenheid om deze structurele puzzels op te lossen. 2D/3D solid state NMR experimenten inschakelen met een hoge resolutie onderzoek naar de samenstelling en architectuur van koolhydraat-rijke materialen in de geboortestaat zonder grote perturbation. Structurele studies zijn met succes uitgevoerd op zowel de primaire als de secundaire celwanden van planten, de catalytically behandelde biomassa, bacteriële biofilm, het pigment geesten in schimmels en, onlangs door de auteurs, de intact celwanden in een pathogene schimmel Aspergillus fumigatus ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31}. de ontwikkeling van dynamische nucleaire polarisatie (DNP)^32,33,34,35,^,36,^{,37,38 , 39 , 40 , 41 ,} NMR structurele opheldering vergemakkelijkt ⁴² aanzienlijk als de verhoging van de gevoeligheid door DNP aanzienlijk de experimentele tijd op deze complexe biomaterialen verkort. Het protocol hier beschreven details over de procedures voor de schimmel A. fumigatus isotoop-labeling en voorbereiden van schimmel en plant monsters voor Solid state NMR en DNP karakterisering. Soortgelijke labeling procedures gelden andere schimmels met gewijzigde medium, en de monsterbereidingsprocedures gelden over het algemeen andere koolhydraatrijke biomaterialen.

Protocol

1. groei van 13C, 15N-geëtiketteerden Aspergillus fumigatus opgietvloeistof Voorbereiding van labelloze en 13C, 15N-geëtiketteerden groeimediumOpmerking: Beide gist Extract pepton Dextrose medium (YPD) en de verbeterde minimaal middellange43 werden gebruikt voor het onderhoud van schimmel cultuur. Alle stappen na autoclaaf zijn uitgevoerd in een laminaire flow kap tot een minimum beperken van verontreiniging. Bereiding va…

Representative Results

De isotoop labeling aanzienlijk verbetert de gevoeligheid van de NMR en maakt het mogelijk voor het meten van een reeks 2D 13C -13C en 13C -15N correlatie spectra voor het analyseren van de samenstelling, hydratatie, mobiliteit en verpakking van polymeren, die zal worden geïntegreerd om te bouwen van een driedimensionaal model van de celwand het platform (Figuur 1). Als de uniforme etikettering slaagt, moet een com…

Discussion

Vergeleken met de biochemische methoden, heeft Solid state NMR voordelen als een niet-destructieve en hoge resolutie techniek. NMR is ook kwantitatieve samenstelling analyse, en in tegenstelling tot de meeste andere analytische methoden, doet niet hebben de onzekerheden ingevoerd door de beperkte oplosbaarheid van biopolymeren. Oprichting van het huidige protocol vergemakkelijkt toekomstige studies op koolhydraat-rijke biomaterialen en matiemaatschappij polymeren. Echter moet worden opgemerkt dat de resonantie-toewijzing…

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
Analytical weighing balance	Ohaus	B730439218	Model PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Biosafety Cabinet	Labconco corporation	302319100
Boric acid	VWR	BDH9222	store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE shaking incubator	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 atom % D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 atom % D
d8-glycerol	Sigma Aldrich	447498	≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa	Sigma Aldrich	D2272	132724
Dipotassium Phosphate	VWR	BDH9266	≥98 %
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fischer Scientific	750004271	Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit	Bruker	B4493	Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate	VWR	10034998	store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate	Alfa Aesar	11563	≥99 %
Monopotassium Phosphate	VWR	470302-254	≥99 %
pH Meter	Mettler Toledo	B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-glycerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor	Cortecnet	B6939
3.2 mm Silicone plug	Bruker	B7089
4 mm MAS Rotor Kit	Bruker	H14355	Zirconia