Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido
Summary
Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.
Abstract
Questo protocollo viene illustrato come uniformemente 13C, 15N-labeled fungine materiali possono essere prodotta e come questi materiali morbidi dovrebbero essere proceduti per NMR allo stato solido e sensibilità avanzata DNP esperimenti. La procedura di elaborazione del campione di biomassa vegetale è anche dettagliata. Questo metodo consente la misurazione di una serie di 1D e 2D 13C –13C / gli spettri di correlazioni15N, che consente ad alta risoluzione delucidazione strutturale dei complessi biomateriali nel loro stato nativo, con minima perturbazione. L’isotopo-etichettatura può essere esaminato da quantificare l’intensità negli spettri di 1D e l’efficienza del trasferimento di polarizzazione negli spettri di correlazione 2D. Il successo della preparazione del campione di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) possa essere valutato per il fattore di aumento di sensibilità. Ulteriori esperimenti esaminando gli aspetti strutturali del polisaccaridi e proteine porterà ad un modello dell’architettura tridimensionale. Questi metodi possono essere modificati e adattati per studiare una vasta gamma di materiali ricchi di carboidrati, tra cui le pareti della cellula naturale di piante, funghi, alghe e batteri, così come sintetizzato o progettato carboidrati polimeri e il loro complesso con altri molecole.
Introduction
Carboidrati svolgono un ruolo centrale in vari processi biologici come stoccaggio di energia, costruzione strutturale e riconoscimento cellulare e adesione. Sono arricchiti nella parete delle cellule, che è un componente fondamentale in piante, funghi, alghe e batteri1,2,3. La parete cellulare funge da una fonte centrale per la produzione di biocombustibili e biomateriali, come pure un bersaglio promettente per terapie antimicrobiche4,5,6,7,8 , 9.
La moderna comprensione di questi materiali complessi è stato sostanzialmente avanzata da decenni di sforzi che sono stati dedicati alla caratterizzazione strutturale utilizzando quattro principali metodi biochimici o genetici. Il primo metodo principale si basa su trattamenti sequenziali utilizzando sostanze chimiche aggressive o enzimi per abbattere i muri della cella in diverse porzioni, che è seguita da compositivo e analisi di linkage di zuccheri in ogni frazione10. Questo metodo mette in luce la distribuzione di dominio dei polimeri, ma l’interpretazione può essere fuorviante a causa delle proprietà chimiche e fisiche di biomolecole. Ad esempio, è difficile determinare se la frazione di alcali-estraibile ha origine da un singolo dominio di molecole meno strutturati o da molecole nello spazio separate con solubilità paragonabile. In secondo luogo, le porzioni estratte o intere pareti della cellula può anche essere misurate utilizzando soluzione NMR per determinare i legami covalenti, anche definiti come reticolazione, tra molecole diverse11,12,13, 14,15. In questo modo, potrebbe essere sondata la struttura dettagliata delle ancore covalente, ma possono esistere limitazioni a causa della bassa solubilità di polisaccaridi, il numero relativamente piccolo di reticolazione siti e l’ignoranza degli effetti non-covalente che stabilizza imballaggio di polisaccaride, inclusi legami a idrogeno, forza di van der Waals, interazione elettrostatica e dell’intrico di polimero. In terzo luogo, l’affinità di legame è stata determinata in vitro utilizzando polisaccaridi isolato16,17,18,19, ma la purificazione delle procedure possono alterare sostanzialmente la struttura e le proprietà di queste biomolecole. Questo metodo inoltre non riesce a replicare la deposizione sofisticato e l’assemblaggio di macromolecole dopo biosintesi. Infine, il fenotipo, morfologia delle cellule e proprietà meccaniche dei mutanti genetici con produzione attenuato di certo componente della parete cellulare capannone luci sulle funzioni strutturali di polisaccaridi, ma prova più molecolare è necessaria per colmare questi osservazioni macroscopiche con la funzione ingegnerizzata di proteina macchinari20.
Recenti progressi nello sviluppo e applicazione della spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale hanno introdotto un’occasione unica per risolvere questi enigmi strutturali. Indagini ad alta risoluzione della composizione e architettura di materiali ricchi di carboidrati nello stato nativo senza perturbazione principali abilitare esperimenti NMR allo stato solido 2D/3D. Studi strutturali sono stati condotti con successo sia primaria e pareti di cella secondaria delle piante, la biomassa cataliticamente trattata, biofilm batterico, il pigmento fantasmi in funghi e, di recente dagli autori, le pareti della cellula intatte in un fungo patogeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. lo sviluppo di polarizzazione nucleare dinamica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 facilita sostanzialmente delucidazione strutturale NMR in quanto l’aumento di sensibilità di DNP contrassegnato riduce il tempo sperimentale su questi biomateriali complessi. Il protocollo descritto qui i dettagli le procedure per la marcatura a isotopi del fungo a. fumigatus e preparando fungine e campioni di piante per la caratterizzazione NMR e DNP a stato solido. Procedure di etichettatura simili dovrebbero essere applicabile ad altri funghi con alterato medio, e le procedure di preparazione del campione dovrebbero essere generalmente applicabile ad altri biomateriali ricchi di carboidrati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Confrontato con i metodi biochimici, NMR allo stato solido ha vantaggi come una tecnica non distruttiva e ad alta risoluzione. NMR è anche in analisi della composizione quantitativa, e a differenza di molti altri metodi analitici, fa non sono le incertezze introdotte dalla solubilità limitata dei biopolimeri. Istituzione dell’attuale protocollo facilita gli studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l’analisi di dati e di assegnazione di risonanza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso NSF OIA-1833040. Il laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) è supportata dalla National Science Foundation attraverso DMR-1157490 e dello stato della Florida. Il sistema di MAS-DNP presso NHMFL è in parte finanziato dal NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.
Materials
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
| Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
| Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
| Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
| Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
| Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
| Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
| d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
| d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
| Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
| Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
| Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
| HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
| Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
| Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
| pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
| Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
| 12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
| 13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
| 15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
| 3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
| 3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
| 4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |
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