Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Summary

Um protocolo para a preparação de ¹³C,¹⁵amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Abstract

Este protocolo mostra como uniformemente ¹³C, ¹⁵N-rotulado materiais fúngicos podem ser produzidos e como estes materiais macios devem ser procedeu para NMR Solid-State e DNP sensibilidade melhorada dos experimentos. O procedimento de processamento da amostra de biomassa de planta também é detalhado. Este método permite a medição de uma série de 1D e 2D ¹³C –¹³C / espectros de correlações¹⁵N, que permite a elucidação estrutural de alta resolução de biomateriais complexos em seu estado nativo, com mínima perturbação. O isótopo-rotulagem pode ser examinado através da quantificação da intensidade em espectros de 1D e a eficiência de transferência de polarização em espectros de correlação 2D. O sucesso da preparação da amostra de polarização nuclear dinâmica (DNP) pode ser avaliado pelo fator de aumento de sensibilidade. Novas experiências, examinando os aspectos estruturais dos polissacarídeos e proteínas conduzirá a um modelo da arquitetura tridimensional. Esses métodos podem ser modificados e adaptados para investigar uma ampla gama de materiais ricos em carboidratos, incluindo as paredes celulares naturais de plantas, fungos, algas e bactérias, bem como sintetizado ou projetado, polímeros de carboidratos e seus complexos com outros moléculas.

Introduction

Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias^1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana^{4,5,6,7,8 , 9}.

A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de¹⁰. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas^{11,12,13, 14,15}. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados^16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries²⁰.

Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31}. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)^{32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42} substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.

Protocol

1. crescimento de 13C, 15N-rotulado Aspergillus fumigatus meio líquido Preparação de sem rótulo e 13C, meio de crescimento N-rotulado de 15Nota: Os dois meio de levedura extrato peptona Dextrose (YPD) e o melhor médio mínimo43 foram utilizados para a manutenção da cultura fúngica. Todas as etapas após a autoclavagem são executadas em uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação. Preparação de meio …

Representative Results

A rotulagem de isótopo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR e torna possível para medir uma série de 13C -15N correlação espectros para analisar a composição, hidratação, mobilidade e 2D 13C -13C e embalagem de polímeros, que serão integrados para construir um modelo tridimensional de arquitetura da parede celular (Figura 1). Se a rotulagem uniforme for bem-sucedido, um conjunto completo de esp…

Discussion

Comparado com os métodos bioquímicos, NMR Solid-State tem vantagens como uma técnica não-destrutiva e em alta resolução. NMR também é quantitativa na análise composicional, e ao contrário da maioria dos outros métodos analíticos, não terá as incertezas introduzido pela solubilidade limitada de biopolímeros. Estabelecimento do protocolo atual facilita estudos futuros sobre biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. No entanto, deve notar-se que a análise de dados e atribuição de res…

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
Analytical weighing balance	Ohaus	B730439218	Model PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Biosafety Cabinet	Labconco corporation	302319100
Boric acid	VWR	BDH9222	store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE shaking incubator	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 atom % D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 atom % D
d8-glycerol	Sigma Aldrich	447498	≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa	Sigma Aldrich	D2272	132724
Dipotassium Phosphate	VWR	BDH9266	≥98 %
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fischer Scientific	750004271	Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit	Bruker	B4493	Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate	VWR	10034998	store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate	Alfa Aesar	11563	≥99 %
Monopotassium Phosphate	VWR	470302-254	≥99 %
pH Meter	Mettler Toledo	B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-glycerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor	Cortecnet	B6939
3.2 mm Silicone plug	Bruker	B7089
4 mm MAS Rotor Kit	Bruker	H14355	Zirconia