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Biochemistry

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

Abstract

이 프로토콜 보여줍니다 얼마나 균일 하 게 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 자료 수 생산과 실험 어떻게이 부드러운 소재 고체 NMR 및 감도 향상 DNP 진행 한다. 식물 바이오 매스의 샘플 처리 절차 또한 상세한입니다. 이 방법을 사용 하면 일련의 1d 및 2D 13C-13C의 측정 /15N 상관 관계 스펙트럼, 최소한의 섭 동으로 그들의 네이티브 국가에서 복잡 한 생체 재료의 고해상도 구조 설명 있습니다. 동위 원소 라벨 1d 스펙트럼의 강도 및 2D 상관 관계 스펙트럼에 분극 전송 효율을 측정 하 여 시험 될 수 있다. 동적인 핵 분극 (DNP) 샘플 준비의 성공 감도 향상 요인에 의해 평가할 수 있습니다. 다 당 류와 단백질의 구조적 측면을 검토 하는 추가 실험 3 차원 구조의 모델 이어질 것입니다. 이러한 메서드를 수정 및 탄수화물이 풍부한 재료, 식물, 균 류, 조류, 박테리아의 자연 세포 벽을 포함 하 여 뿐 아니라 합성 또는 탄수화물 중합체 및 다른 그들의 복잡 한 디자인의 넓은 범위를 조사 하기 위해 적응 수 있습니다. 분자입니다.

Introduction

탄수화물은 에너지 저장, 구조 건물, 및 세포 인식 및 접착 등 다양 한 생물학 과정에서 중심 역할을 한다. 그들은 세포 벽에 식물, 균 류, 조류, 박테리아1,2,3의 기본적인 구성 요소는 농축 됩니다. 세포 벽 역할을 항균 요법4,,56,7,8 대 유망 대상으로 바이오 연료 및 바이오 소재의 생산에 대 한 중앙 소스 , 9.

이러한 복잡 한 자료의 현대 이해는 수 십년의 4 개의 주요 생 화 확 적인 또는 유전자 방법을 사용 하 여 구조적 특성에 전념 했다 노력에 의해 실질적으로 고급 되었습니다. 첫 번째 주요 방법 의존 순차적 치료 가혹한 화학 물질이 나 효소를 사용 하 여 다른 부분으로 세포 벽을 무 너 뜨 리는 뒤에 작곡 및 각 분수10에서 설탕의 연계 분석. 이 방법은 고분자, 도메인 배포에 광명 하지만 해석 생체의 화학 및 물리적 특성으로 인해 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 예를 들어 알칼리 추출 물 분수 유래와 비교 해도 덜 구조화 된 분자의 단일 도메인에서 또는 공간적으로 분리 된 분자에서 여부를 결정 하기가 어렵습니다. 둘째, 추출 된 부분 또는 전체 세포 벽 또한 측정 될 수 있다 또한 다른 분자11,12,13, 사이의 가교 되 나 공유 결합을 솔루션 NMR을 사용 하 여 14,15. 이 방법에서는, 화학식 앵커의 상세한 구조를 탐색할 수, 있지만 제한 류, 상대적으로 적은 수의 가교 사이트 및 안정화 비 공유 효과의 무지의 낮은 용 해도 인해 있을 수 있습니다. 다 당 류 패킹, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 정전기 상호 작용 및 폴리머 녹 채를 포함 하 여. 셋째, 바인딩 선호도 결정 있다 생체 외에서 사용 하 여 절연된 류16,,1718,19, 정화 절차를 실질적으로 변경할 수 있습니다. 구조와 이러한 생체의 속성입니다. 이 메서드는 또한 정교한 증 착 및 생 합성 후 고분자의 어셈블리를 복제 하도록 실패 합니다. 마지막으로, 표현 형, 세포 형태학 및 특정 세포 벽 구성 요소의 감쇠 생산 유전 돌연변이의 기계적 성질 류의 구조 기능에 조명 하지만 더 분자 증거 이러한 다리 필요 단백질 기계20의 조작된 기능을 가진 거시적인 관측.

개발 및 응용 프로그램 다차원 고체 NMR 분광학의 최근 발전 구조 퍼즐을 해결 하기 위한 독특한 기회를 도입 했습니다. 2D/3D 고체 NMR 실험 구성의 고해상도 조사 및 주요 섭 동 하지 않고 기본 상태에서 탄수화물이 풍부한 재료의 아키텍처를 사용합니다. 1 차 및 2 차 세포 벽 식물, 촉매로 처리 바이오 매스의 구조 연구가 성공적으로 실시 되어 세균의 biofilm 안료 유령 버섯에 그리고, 최근에 작가, 병원 성 균 류에서 그대로 세포 벽에 의해 Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. 동적인 핵 분극 (DNP)32,33,34,35,36,,3738 의 개발 , 39 , 40 , 41 , DNP로 감도 향상 현저 하 게 단축에 이러한 복잡 한 생체 실험 시간 42 실질적으로 NMR 구조 설명을 촉진 한다. 여기에 설명 된 프로토콜 동위 원소 레이블 A. fumigatus 곰 팡이 및 곰 팡이 준비 절차 및 공장 샘플 고체 NMR 및 DNP 특성화에 대 한 자세히 설명 합니다. 유사한 라벨 절차 변경 된 매체와 다른 균에 적용 되어야 합니다 그리고 샘플 준비 절차 다른 탄수화물이 풍부한 생체 재료에 일반적으로 적용 되어야 합니다.

Protocol

1. 13C, 15N 표시 Aspergillus fumigatus 성장의 액체 매체 레이블이 없는의 준비와 13C, 15N 표시 된 성장 매체참고: 모두 효 모 추출 물 펩 포도 당 매체 (YPD)와 향상 된 최소한의 중간43 곰 팡이 문화 유지 관리를 위해 사용 되었다. 압력가 마로 소독 후 모든 단계는 오염을 최소화 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다. 레이블이 없는 …

Representative Results

실질적으로 NMR 감도 강화 하 고 2D 13C-13C와 13C-15N 상관 관계 스펙트럼 분석 구성, 수 화, 이동성을 일련의 측정 및 포장의 가능 하 게 동위 원소 라벨 중합체 세포 벽 구조 (그림 1)의 3 차원 모델을 생성 하는 통합 된 것입니다. 성공 하면 균일 한 라벨 1 D 13C와 15N 스펙트럼의 완전 한 세트는 1 시간 이내 ?…

Discussion

생 화 확 적인 방법에 비해, 고체 NMR 장점이 아닌-파괴 및 고해상도 기술로. NMR 작곡 분석, 양적 이며 또한 대부분의 다른 분석 방법과 달리 않습니다는 불확실성에 의해 소개 되지 biopolymers의 한정 된 가용성. 현재 프로토콜의 탄수화물이 풍부한 바이오 소재 및 기능성된 고분자에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다. 그러나, 그것은 유의 공명 할당 및 데이터 분석 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 및 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 과학 재단 NSF OIA-1833040를 통해 지원 되었다. 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) DMR 1157490와 플로리다의 상태를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 됩니다. NHMFL에서 매스 DNP 시스템 S10 OD018519 NIH와 NSF 체-1229170에 의해 일부 자금입니다.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
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