تحريض التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن الأدوية في الفئران BALB / c لدراسة آلياته المسببة للأمراض
Summary
نحن نصف نموذج التحصين في الجسم الحي ، والتهاب الكبد الانتقالي في الفئران BALB / c التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات بما في ذلك الاختلافات بين الجنسين التي شوهدت في هذا المرض. سنصف كيف يوضح هذا النموذج التحليلات القابلة للتكرار باستخدام التقنيات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر.
Abstract
التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوحظت في حوالي 9 إلى 12 ٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المناعي الذاتي. الغالبية العظمى من المرضى الذين يعانون من DIH هم من النساء. الآليات الكامنة وراء هذه الاختلافات بين الجنسين في الانتشار غير واضحة بسبب ندرة النماذج الحيوانية التي تحاكي الأمراض البشرية. ومع ذلك ، يعتقد على نطاق واسع أن الآليات الأساسية مرتبطة بالأنماط الفردية لمستضدات الكريات البيض البشرية والهرمونات الجنسية. في المقابل ، باستخدام نموذج فأر DIH ، اكتشفنا أن خلايا CD4 + T التي بدأت IL-4 موجهة ضد ظهارة من السيتوكروم P450 2E1 تحفز تدفق العدلات والبلاعم والخلايا البدينة إلى كبد الفئران BALB / c. باستخدام هذا النموذج ، أظهرنا أيضا أن الخلايا التائية FoxP3 + التنظيمية المستحثة ب IL-33 تمنح الحماية ضد DIH في الفئران الإناث والذكور. يتم تحفيز نموذج DIH هذا عن طريق تحصين الفئران ب CYP2E1 الذي تم تغييره تساهميا باستخدام مستقلب دوائي ارتبط ب DIH. يتم التعرف على هذا epitope من قبل المرضى الذين يعانون من DIH. طريقتنا تحفز التهاب الكبد القوي والقابل للتكرار والأجسام المضادة الذاتية التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في DIH. في حين أن الدراسات في الجسم الحي يمكن أن تسبب ألما وضيقا لا مبرر له في الفئران عند القيام به بشكل غير صحيح ، فإن ميزة نموذج في الجسم الحي هي القدرة على تقييم التسبب في المرض في عدد كبير من الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة الآثار البيولوجية لبروتينات الكبد المتغيرة باستخدام الإجراءات الغازية. تسمح إضافة الدراسات في المختبر إلى التصميم التجريبي بالتكرار السريع والتحليل الميكانيكي على المستوى الخلوي. وبالتالي ، سنوضح بروتوكولنا النموذجي وكيف يمكن استخدامه للدراسة في الجسم الحي وفي آليات المختبر ل DIH.
Introduction
الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج الفأر لالتهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات الذي يتطور في الجسم الحي وتوضيح كيف يمكن استخدامه للتحقيق في الأساس الجزيئي والمناعي والجيني لهذا المرض. الهدف طويل الأجل من دراساتنا هو الكشف عن الآليات المسؤولة عن تطور التهاب الكبد المزمن والإصابة من خلال دراسة DIH في المرضى المعرضين للخطر. تشكل أمراض الكبد وتليف الكبد سادس أكثر أسباب الوفاة شيوعا لدى البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 64 عاما. DILI الفريد ، الذي يشار إليه أحيانا باسم التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو السبب الثالث الأكثر شيوعا لفشل الكبد الحاد في الولايات المتحدة. DIH هي عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوحظت في حوالي 9 إلى 12 ٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المناعي الذاتي1. الغالبية العظمى من المرضى الذين يعانون من DIH هم من النساء2،3،4. يتطور نوع من DIH في الأفراد المعرضين للإصابة بعد إعطاء التخدير المتطاير المهلجنة مثل الأيزوفلوران أو السيفوفلوران أو ديسفلوران أو الهالوثان. ترتبط هذه التخدير تساهميا ببروتينات الكبد مع المنتجات التفاعلية لعملية التمثيل الغذائي الخاصة بها ، وبالتالي خلق مستضدات ذاتية جديدة قادرة على إثارة استجابات الحساسية أو المناعة الذاتية5.
كانت دراسة الآليات المسببة للأمراض المشاركة في تطوير المخدر وأي شكل من أشكال DIH قد أعيقت سابقا بسبب عدم وجود نموذج حيواني يحاكي عن كثب تحريض الأمراض البشرية. لقد طورنا نموذجا تجريبيا للفئران من DIH مع ميزات تشبه DILI بوساطة المناعة في المرضى. يحدث التهاب الكبد عن طريق التحصين بأحد المستضددين الذاتيين اللذين تم تعديلهما تساهميا بواسطة مستقلب كلوريد ثلاثي فلورو أسيتيل (TFA) الذي يتشكل بعد التمثيل الغذائي التأكسدي للمخدر بواسطة إنزيم السيتوكروم P450 2E1 (CYP2E1)5. أحد المستضدات الذاتية هو جزء الكبد الكبدي S100 الخلوي ، وهو مزيج من عدة بروتينات6 ، والمستضد الذاتي الثاني هو ظهارة من CYP2E1 التي يتم التعرف عليها بواسطة الأمصال من المرضى الذين يعانون من DILI7 بوساطة المناعة المخدرة. باستخدام الفئران BALB / c ، التي تقاوم نسبيا التهاب الكبد المناعي الذاتي التجريبي ، نميز نموذجنا عن نموذج التحصين الناجم عن S100 لالتهاب الكبد المناعي الذاتي في الفئران C57Bl / 6J8.
بسبب عروضها السريرية المتنوعة ، يصعب دراسة DIH على المرضى. توفر النماذج التجريبية الانتقالية القدرة على تقييم التسبب في المرض في الجسم الحي وفي المختبر. في الوقت الحاضر ، لا توجد طرق بديلة أخرى لتحفيز DIH التي تدرس بالكامل في الجسم الحي أو في المختبر الاستجابات المناعية التكيفية أو الفطرية دون استخدام الحيوانات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن ثلاثي فلورو أسيتيلات S-100 أو CYP2E1 epitope لا يبدو أنه ينتج مناعة مزعجة ، ونحن نحث DIH عن طريق التحصين بالبروتينات المعدلة بواسطة TFA ، فإن هذه الحيوانات لن تتلقى الأثير أو أي مخدر مهلجنة أو باربيتورات أو كحول قبل التحصين أو الإجراءات الأخرى ، مع الأخذ في الاعتبار أن هذه العوامل قد تغير المعلمات التي ندرسها. ومع ذلك ، فقد قللنا من استخدامنا للفئران من خلال استخدام المحاكاة الحاسوبية لتأكيد التفضيلات الملزمة ل CYP2E1 epitope9 المكتشفة لدينا وعكسنا DIH البشري الذي يورط الجنس الأنثوي من خلال إثبات أن الفئران BALB / c الإناث تطور DIH10 أكثر حدة.
على الرغم من العروض المتنوعة ل DIH في المرضى والتحديات في دراسة الأمراض السريرية ، فإن التعديل اللاحق للبروتينات الأصلية بواسطة مستقلبات الأدوية التفاعلية هو آلية رئيسية مقبولة في التسبب في DIH الذي يتبع التخدير المهلجنة11. يقبل المحققون أيضا أن CYP2E1 هو مستضد ذاتي رئيسي في هذه العملية12,13. إن دور خلايا الإنترلوكين (IL)-4-CD4 + T غير المنظمة التي تتعرف على CYP2E1 المعدل بعد الترجمة وبروتينات الكبد الأخرى هو مبادر مقبول ل DIH المخدر عن طريق جذب العدلات والحمضات والخلايا البدينة إلى الكبد14 ، وقد تم تأكيد هذه الآلية في أشكال عديدة من DIH15,16. تقلل الخلايا المستحثة التي تعبر عن FoxP3 CD4 + CD25 + T (Tregs) من شدة DIH ، وأوجه القصور النسبية لهذه الخلايا في الطحال تزداد سوءا DIH 10,7. وبالتالي ، فإن غالبية التقدم في فهم DIH قد أصبح ممكنا من خلال استخدام نماذج الفئران في الجسم الحي لتقييم الآليات الوراثية والأيضية والمناعية ل DIH في كل من الجسم الحي والمختبر.
نظرا لأننا اكتشفنا نحن والمحققون الآخرون أدوارا ل IL-4 والعدلات والحمضات في بدء DIH باستخدام نماذج مختلفة للفئران ، نعتقد أن هذه الملاحظة تدعم زعمنا بأنه بغض النظر عن نموذج DIH المستخدم ، فإن التهاب الكبد والإصابة يسببان بواسطة IL-4. تكمن قوة بروتوكولنا في استخدام منهجية في الجسم الحي ، سواء الفئران الذكور أو الإناث ، وتكرار علم الأنسجة ، واختبارات انتشار الخلايا التائية CD4 + والسيتوكينات. تكمن قوة استخدامنا للدراسات المخبرية في أنها تقلل من أعداد الفئران اللازمة مع توفير منهجية لعزل التفاعلات الخلوية التي تدفع DIH. نوصي باستخدام الفئران من الذكور والإناث لأن هذا يقلل من إمكانية التحيز اللاواعي في تفسير النتائج ويعزز إمكانات الترجمة لدراساتنا لأن حدوث وانتشار وشدة DIH أعلى لدى النساء17. نوصي بالحصول على الفئران من بائع واحد. ومع ذلك ، إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فاحصل على عناصر تحكم في رفيقة القمامة أو الفئران من النوع البري من نفس البائع مثل الفئران المعدلة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتكمن قوة هذا البروتوكول في قابليته للتكرار؛ لذلك ، من الأهمية بمكان الالتزام بالخطوات المقترحة. صياغة المناعي يمكن أن يكون حاجزا للبعض. ومع ذلك ، قمنا بإعادة إنتاج نموذجنا باستخدام epitope الموصوف في وثيقتنا ، والذي يزيل الحاجة إلى عزل جزء S100 من الكبد. ومن المحتمل أن تكون هناك ظواهر أو بروتي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود الدكتور نجوكو أن يعرب عن تقديره للدكتور نويل روز، الحاصل على درجة الدكتوراه في الطب، على توجيهاته ومناقشاته الثاقبة التي أسفرت عن صياغة هذا النموذج.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
