نحن نصف نموذج التحصين في الجسم الحي ، والتهاب الكبد الانتقالي في الفئران BALB / c التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات بما في ذلك الاختلافات بين الجنسين التي شوهدت في هذا المرض. سنصف كيف يوضح هذا النموذج التحليلات القابلة للتكرار باستخدام التقنيات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحريض التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن الأدوية في الفئران BALB / c لدراسة آلياته المسببة للأمراض
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوحظت في حوالي 9 إلى 12 ٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المناعي الذاتي. الغالبية العظمى من المرضى الذين يعانون من DIH هم من النساء. الآليات الكامنة وراء هذه الاختلافات بين الجنسين في الانتشار غير واضحة بسبب ندرة النماذج الحيوانية التي تحاكي الأمراض البشرية. ومع ذلك ، يعتقد على نطاق واسع أن الآليات الأساسية مرتبطة بالأنماط الفردية لمستضدات الكريات البيض البشرية والهرمونات الجنسية. في المقابل ، باستخدام نموذج فأر DIH ، اكتشفنا أن خلايا CD4 + T التي بدأت IL-4 موجهة ضد ظهارة من السيتوكروم P450 2E1 تحفز تدفق العدلات والبلاعم والخلايا البدينة إلى كبد الفئران BALB / c. باستخدام هذا النموذج ، أظهرنا أيضا أن الخلايا التائية FoxP3 + التنظيمية المستحثة ب IL-33 تمنح الحماية ضد DIH في الفئران الإناث والذكور. يتم تحفيز نموذج DIH هذا عن طريق تحصين الفئران ب CYP2E1 الذي تم تغييره تساهميا باستخدام مستقلب دوائي ارتبط ب DIH. يتم التعرف على هذا epitope من قبل المرضى الذين يعانون من DIH. طريقتنا تحفز التهاب الكبد القوي والقابل للتكرار والأجسام المضادة الذاتية التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في DIH. في حين أن الدراسات في الجسم الحي يمكن أن تسبب ألما وضيقا لا مبرر له في الفئران عند القيام به بشكل غير صحيح ، فإن ميزة نموذج في الجسم الحي هي القدرة على تقييم التسبب في المرض في عدد كبير من الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة الآثار البيولوجية لبروتينات الكبد المتغيرة باستخدام الإجراءات الغازية. تسمح إضافة الدراسات في المختبر إلى التصميم التجريبي بالتكرار السريع والتحليل الميكانيكي على المستوى الخلوي. وبالتالي ، سنوضح بروتوكولنا النموذجي وكيف يمكن استخدامه للدراسة في الجسم الحي وفي آليات المختبر ل DIH.
المقدمة
الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج الفأر لالتهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات الذي يتطور في الجسم الحي وتوضيح كيف يمكن استخدامه للتحقيق في الأساس الجزيئي والمناعي والجيني لهذا المرض. الهدف طويل الأجل من دراساتنا هو الكشف عن الآليات المسؤولة عن تطور التهاب الكبد المزمن والإصابة من خلال دراسة DIH في المرضى المعرضين للخطر. تشكل أمراض الكبد وتليف الكبد سادس أكثر أسباب الوفاة شيوعا لدى البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 64 عاما. DILI الفريد ، الذي يشار إليه أحيانا باسم التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات (DIH) هو السبب الثالث الأكثر شيوعا لفشل الكبد الحاد في الولايات المتحدة. DIH هي عملية فرط الحساسية الأكثر شيوعا التي يسببها الدواء الكبدي التي لوح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات.
1. ثلاثي فلورو أسيتيلات البروتينات الخلوية الكبدية S-100 أو ظهارة CYP2E1
ملاحظة: أولا ، قم بإعداد S100 ثلاثي فلورو أسيتيلات (TFA-S100) و CYP2E1 ثلاثي فلورو أسيتيلات (TFA-JHDN5). لأن هناك حاجة إلى بروتينات S100 syngeneic للتحصينات ، والفئران BALB / c مطلوبة لإنتاج المولدات المناعية. التحضير ينتج كمية كبيرة من المناعة. لذلك ، توقع أداء هذا الجزء حوالي أربع مرات في السنة. سيتم استخدام طريقة مماثلة لصنع TFA-JHDN5. يمكن تسلسل أو شراء CYP2E1 epitope (JHDN5) ، GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL.
- عزل جزء S100 من الكبد. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمثل جدول التحصين المستخدم للحث على DIH الموضح في الشكل 1 التحصينين المطلوبين في قاعدة الرقبة (اليوم 0) وقاعدة الذيل (اليوم 7). ويبين الشكل 2 بيانات الانتشار التمثيلية التي تم الحصول عليها في اليوم 14 باستخدام CFSE استجابة ل CYP2E1 و JHDN5 و CYP2E1 epitope ومستقلب ثلاثي فلورو أسيتيل (TFA) للمخدرات. يوضح الشكل 3 استراتيجية البوابات وتحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي ل CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs المستحثة التي تم الحصول عليها في اليوم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتكمن قوة هذا البروتوكول في قابليته للتكرار؛ لذلك ، من الأهمية بمكان الالتزام بالخطوات المقترحة. صياغة المناعي يمكن أن يكون حاجزا للبعض. ومع ذلك ، قمنا بإعادة إنتاج نموذجنا باستخدام epitope الموصوف في وثيقتنا ، والذي يزيل الحاجة إلى عزل جزء S100 من الكبد. ومن المحتمل أن تكون هناك ظواهر أو بروتينات إضافية يمكن تغييرها وإحداث التهاب الكبد بعد التحصينات؛ ومع ذلك ، فإننا نصف تلك البروتينات التي استخدمناها مع نتائج موثوقة. وقد ثبت أن العديد من البروتينات تكون ثلاثية فلورو أسيتيل عند التعرض للمخدر المهلجنة . على الأرجح بسبب ان.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويود الدكتور نجوكو أن يعرب عن تقديره للدكتور نويل روز، الحاصل على درجة الدكتوراه في الطب، على توجيهاته ومناقشاته الثاقبة التي أسفرت عن صياغة هذا النموذج.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.1٪ 2،4،6-حمض السلفونيك ثلاثي نيتروبنزين (TNBS) ThermoFisher | 28997 | ||
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB / c الفئران | Jackson | ||
| CellTrace & trade ؛ طقم تكاثر الخلايا CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| كاشف حجب FcR | Milteyi | 130-092-575 | |
| المكمل العام | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG & trade الخلايا المحفوظة بالتبريد | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| لايف / ميت قابل للإصلاح طقم بقع Aqua Dead Cell | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll & reg ؛ | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| السموم السعال الديكي | بيولوجية | 180 | |
| فوسفات مخزن محلول ملحي درجة الحموضة 7.4 | مختلف | ||
| بيرس & تجارة; أقراص صغيرة مثبطات البروتياز ، EDTA خالية | من ThermoFisher | 88666 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| أشرطة غسيل الكلى Slide-a-lyzer (10 K ، 12 مل) ThermoFisher | 66810 | ||
| UltraPure & trade ؛ حل SDS ، 10٪ | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E ، بدون فينول أحمر | ThermoFisher | A1217601 |
المراجع
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
