Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos
Summary
Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.
Abstract
La hepatitis autoinmune inducida por fármacos (DIH) es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente el 9 al 12% de los pacientes con hepatitis autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres. Los mecanismos subyacentes de estas diferencias de sexo en la prevalencia no están claros debido a la escasez de modelos animales que imitan la enfermedad humana. Aun así, se cree ampliamente que los mecanismos subyacentes están asociados con los haplotipos de antígenos leucocitarios humanos y las hormonas sexuales. En contraste, utilizando un modelo de ratón DIH, hemos descubierto que las células T CD4 + iniciadas por IL-4 dirigidas contra un epítopo del citocromo P450 2E1 inducen la afluencia de neutrófilos, macrófagos y mastocitos en los hígados de ratones hembra BALB / c. Usando este modelo, también hemos demostrado que las células T reguladoras FoxP3 + inducidas por IL-33 confieren protección contra DIH en ratones hembras y machos. Este modelo de DIH es inducido por la inmunización de ratones con un epítopo de CYP2E1 que ha sido alterado covalentemente con un metabolito del fármaco que se ha asociado con DIH. Este epítopo es reconocido por pacientes con DIH. Nuestro método induce hepatitis y autoanticuerpos robustos y reproducibles que se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de la DIH. Si bien los estudios in vivo pueden causar dolor y angustia indebidos en ratones cuando se realizan incorrectamente, la ventaja de un modelo in vivo es la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad en un gran número de ratones. Además, los efectos biológicos de las proteínas hepáticas alteradas se pueden estudiar mediante procedimientos invasivos. La adición de estudios in vitro al diseño experimental permite una rápida repetición y análisis mecanicista a nivel celular. Por lo tanto, demostraremos nuestro protocolo modelo y cómo se puede utilizar para estudiar los mecanismos in vivo e in vitro de DIH.
Introduction
El propósito de este método es describir un modelo de ratón de hepatitis autoinmune inducida por fármacos que se desarrolla in vivo y demostrar cómo se puede utilizar para investigar las bases moleculares, inmunológicas y genéticas de esta enfermedad. El objetivo a largo plazo de nuestros estudios es descubrir mecanismos responsables del desarrollo de inflamación y lesión hepática crónica mediante el estudio de la DIH en pacientes susceptibles. La enfermedad hepática y la cirrosis constituyen la sexta causa más común de muerte en adultos entre las edades de 25 y 64 años. El DILI idiosincrásico, a veces denominado hepatitis autoinmune inducida por medicamentos (DIH, por sus siglas en inglés) es la tercera causa más común de insuficiencia hepática aguda en los Estados Unidos. DiH es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente 9 a 12% de los pacientes con hepatitis1 autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres 2,3,4. Un tipo de DIH se desarrolla en individuos susceptibles después de la administración de anestésicos volátiles halogenados como isoflurano, sevoflurano, desflurano o halotano. Estos anestésicos se unen covalentemente a las proteínas hepáticas con productos reactivos de su metabolismo, creando así nuevos autoantígenos capaces de provocar respuestas alérgicas o autoinmunes5.
El estudio de los mecanismos patógenos involucrados en el desarrollo de anestésicos y cualquier forma de DIH se ha visto obstaculizado previamente por la falta de un modelo animal que imite de cerca la inducción de la enfermedad humana. Hemos desarrollado un modelo murino experimental de DIH con características que se asemejan a DILI inmunomediado en pacientes. La hepatitis es inducida por la inmunización con uno de los dos autoantígenos que han sido modificados covalentemente por el metabolito cloruro de trifluoroacetilo (TFA) que se forma después del metabolismo oxidativo del anestésico por la enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantígeno es la fracción hepática citosólica S100 hepática, que es una mezcla de varias proteínas6, y el segundo autoantígeno es un epítopo de CYP2E1 que es reconocido por sueros de pacientes con DILI7 inmunomediado con anestesia. Mediante el uso de ratones BALB/c, que son relativamente resistentes a la hepatitis autoinmune experimental, distinguimos nuestro modelo del modelo de inmunización inducido por S100 de hepatitis autoinmune en ratones C57Bl/6J8.
Debido a sus diversas presentaciones clínicas, la DIH es difícil de estudiar en pacientes. Los modelos experimentales traslacionales ofrecen la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad in vivo e in vitro. En la actualidad, no existen otros métodos alternativos para inducir diH que examinen completamente las respuestas inmunes adaptativas o innatas in vivo o in vitro sin el uso de animales. Además, dado que la trifluoroacetilación de S-100 o del epítopo CYP2E1 no parece producir un inmunógeno irritante, y estamos induciendo DIH mediante la inmunización con proteínas alteradas por TFA, estos animales no recibirán éter, ningún anestésico halogenado, barbitúrico o alcohol antes de la inmunización u otros procedimientos, considerando que estos agentes pueden alterar los parámetros que estamos estudiando. Aun así, hemos disminuido nuestro uso de ratones mediante el uso de simulación por computadora para confirmar las preferencias de unión de nuestro epítopo CYP2E1descubierto 9 y hemos reflejado el DIH humano que implica el sexo femenino al demostrar que los ratones hembra BALB / c desarrollan un DIH10 más severo.
A pesar de las diversas presentaciones de DIH en pacientes y los desafíos en el estudio de la enfermedad clínica, la modificación post-traduccional de proteínas nativas por metabolitos reactivos de fármacos es un mecanismo clave aceptado en la patogénesis DIH que sigue a los anestésicos halogenados11. Los investigadores también aceptan que cyp2E1 es un autoantígeno importante en este proceso12,13. El papel de las células T CD4+reguladas por la interleucina (IL)-4-upregulated que reconocen un CYP2E1 modificado post-traduccionalmente y otras proteínas hepáticas es un iniciador aceptado de DIH anestésico al atraer neutrófilos, eosinófilos y mastocitos al hígado14, y este mecanismo se ha confirmado en muchas formas de DIH15,16. Las células T CD4+CD25+(Tregs) que expresan FoxP3 inducidas reducen la gravedad de la DIH, y las deficiencias relativas de estas células en el bazo empeoran la DIH 10,7. Por lo tanto, la mayoría de los avances en la comprensión de la DIH han sido posibles mediante la utilización de modelos de ratón in vivo para evaluar los mecanismos genéticos, metabólicos e inmunológicos de la DIH tanto in vivo como in vitro.
Debido a que nosotros y otros investigadores hemos descubierto roles para IL-4, neutrófilos y eosinófilos en el inicio de DIH utilizando diferentes modelos de ratón, creemos que esta observación apoya nuestra afirmación de que, independientemente del modelo DIH utilizado, la hepatitis y las lesiones son inducidas por IL-4. La fuerza de nuestro protocolo radica en la utilización de la metodología in vivo, tanto en ratones machos como hembras, y la repetición de histología, ensayos de proliferación de células T CD4+ y citoquinas. La fuerza de nuestro uso de estudios in vitro es que reducen el número de ratones necesarios al tiempo que proporcionan la metodología para aislar las interacciones celulares que impulsan la DIH. Recomendamos el uso de ratones machos y hembras porque esto reduce la posibilidad de sesgo inconsciente en la interpretación de los resultados y fortalece el potencial de traducción de nuestros estudios, ya que la incidencia, prevalencia y gravedad de la DIH es mayor en las mujeres17. Recomendamos que los ratones se obtengan de un solo proveedor; sin embargo, si esto no es posible, obtenga controles de pareja de camada o ratones de tipo salvaje del mismo proveedor que los ratones genéticamente alterados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fuerza de este protocolo radica en su reproducibilidad; por lo tanto, es fundamental cumplir con los pasos sugeridos. La formulación del inmunógeno puede ser una barrera para algunos; sin embargo, hemos reproducido nuestro modelo utilizando el epítopo descrito en nuestro documento, que elimina la necesidad de aislar la fracción S100 del hígado. Es probable que se puedan alterar epítopos o proteínas adicionales e inducir hepatitis después de las inmunizaciones; sin embargo, describimos aquellas proteínas que h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Dr. Njoku desea agradecer al Dr. Noel R. Rose, MD PhD, por su orientación y discusiones perspicaces que resultaron en la formulación de este modelo.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
