אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה
Summary
אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.
Abstract
הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) היא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות נגד הכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשים. המנגנונים הבסיסיים של הבדלי מין אלה בשכיחות אינם ברורים בגלל מיעוט המודלים של בעלי חיים המחקים מחלות אנושיות. עם זאת, מנגנונים בסיסיים נחשבים בעיני רבים כקשורים להפלוטיפים של אנטיגן לויקוציטים אנושי ולהורמוני מין. לעומת זאת, באמצעות מודל של עכבר DIH, גילינו כי IL-4 יזם תאי CD4+ T המכוונים נגד אפיטופ של ציטוכרום P450 2E1 גורם לזרימה של נויטרופילים, מקרופאגים ותאי פיטום לתוך הכבדים של נקבות עכברי BALB/c. באמצעות מודל זה, הראינו גם שתאי T רגולטוריים של FoxP3+המושרים על ידי IL-33 מעניקים הגנה מפני DIH בעכברים נקביים וזכריים. מודל DIH זה מושרה על ידי חיסון עכברים עם אפיטופ של CYP2E1 אשר השתנה באופן קוולנטי עם מטבוליט של תרופה שנקשרה ל- DIH. אפיטופ זה מוכר על ידי חולים עם DIH. השיטה שלנו גורמת להפטיטיס חזקה וניתנה לשחזור ולנוגדנים עצמיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפתוגנזה של DIH. בעוד שמחקרי in vivo יכולים לגרום לכאב ומצוקה מיותרים בעכברים כאשר הם נעשים בצורה לא נכונה, היתרון של מודל in vivo הוא היכולת להעריך את הפתוגנזה של המחלה במספר רב של עכברים. בנוסף, ניתן לחקור את ההשפעות הביולוגיות של חלבוני הכבד שהשתנו באמצעות הליכים פולשניים. הוספת מחקרי מבחנה לתכנון הניסויי מאפשרת חזרה מהירה וניתוח מכניסטי ברמה התאית. לפיכך, נדגים את פרוטוקול המודל שלנו וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנוני in vivo ו- in vitro של DIH.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות המתפתחת in vivo ולהדגים כיצד ניתן להשתמש בה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי, האימונולוגי והגנטי של מחלה זו. המטרה ארוכת הטווח של המחקרים שלנו היא לחשוף מנגנונים האחראים להתפתחות דלקת כרונית בכבד ופציעה על ידי מחקר DIH בחולים רגישים. מחלת כבד ושחמת הכבד מהוות את סיבת המוות השישית בשכיחותה בקרב מבוגרים בין הגילאים 25 ל -64. DILI אידיוסינקרטי, המכונה לעתים הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות (DIH) הוא הגורם השלישי בשכיחותו לאי ספיקת כבד חריפה בארצות הברית. DIH הוא תהליך הרגישות היתר הנפוץ ביותר המושרה על ידי תרופות בכבד שנצפה בכ-9 עד 12% מהחולים עם הפטיטיס אוטואימונית1. הרוב המכריע של החולים עם DIH הן נשיםבנות 2,3,4. סוג של DIH מתפתח אצל אנשים רגישים לאחר מתן של הרדמה נדיפה הלוגנית כגון איזופלורן, sevoflurane, desflurane או halothane. הרדמה זו נקשרת באופן קוולנטי לחלבוני כבד עם מוצרים תגובתיים של חילוף החומרים שלהם, ובכך יוצרת נוגדנים עצמיים חדשניים המסוגלים לעורר תגובות אלרגיות או אוטואימוניות5.
המחקר של מנגנונים פתוגניים המעורבים בהתפתחות של הרדמה וכל צורה של DIH הופרע בעבר על ידי היעדר מודל חייתי המחקה באופן הדוק את האינדוקציה של מחלות אנושיות. פיתחנו מודל מורין ניסיוני של DIH עם תכונות הדומות ל-DILI בתיווך מערכת החיסון בחולים. הפטיטיס מושרית על ידי חיסון עם אחד משני נוגדנים עצמיים ששונו באופן קוולנטי על ידי מטבוליט טריפלואורואצטיל כלוריד (TFA) שנוצר בעקבות חילוף חומרים חמצוני של ההרדמה על ידי האנזים ציטוכרום P450 2E1 (CYP2E1)5. אוטונטיגן אחד הוא שבר הכבד הציטוזולי S100 בכבד, שהוא תערובת של מספר חלבונים6, והאנטיגן האוטו-אנטיגן השני הוא אפיטופ של CYP2E1 המוכר על ידי סרה מחולים עם DILI7 המתווך על ידי מערכת החיסון. על ידי שימוש בעכברי BALB/c, שהם עמידים יחסית להפטיטיס אוטואימונית ניסיונית, אנו מבחינים את המודל שלנו ממודל החיסון המושרה על ידי S100 של הפטיטיס אוטואימונית בעכברי C57Bl/6J8.
בגלל המצגות הקליניות המגוונות שלו, DIH קשה למחקר בחולים. מודלים ניסיוניים תרגומיים מציעים את היכולת להעריך את הפתוגנזה של מחלות in vivo ו- in vitro. נכון לעכשיו, אין שיטות חלופיות אחרות לגרימת DIH הבוחנות באופן מלא תגובות חיסוניות in vivo או in vitro מסתגלות או מולדות ללא שימוש בבעלי חיים. יתר על כן, מכיוון שנראה כי טריפלואורואצטילציה של S-100 או אפיטופ CYP2E1 אינה מייצרת אימונוגן מגרה, ואנו גורמים ל- DIH על ידי חיסון עם חלבונים ששונו על ידי TFA, בעלי חיים אלה לא יקבלו אתר, כל הרדמה הלוגנית, ברביטורט או אלכוהול לפני חיסון או הליכים אחרים, בהתחשב בכך שסוכנים אלה עשויים לשנות את הפרמטרים שאנו חוקרים. אף על פי כן, צמצמנו את השימוש בעכבר שלנו על ידי שימוש בהדמיית מחשב כדי לאשר את העדפות הקשירה של האפיטופ CYP2E1 שהתגלה עלידי כך ששיקפו את ה-DIH האנושי המעורב במין הנשי על ידי הוכחה שנקבות עכברי BALB/c מפתחות DIH10 חמור יותר.
למרות מצגות מגוונות של DIH בחולים ואתגרים בחקר מחלות קליניות, שינוי לאחר התרגום של חלבונים מקומיים על ידי מטבוליטים של תרופות תגובתיות הוא מנגנון מפתח מקובל בפתוגנזה DIH העוקב אחר הרדמה הלוגנית11. החוקרים גם מקבלים את העובדה ש-CYP2E1 הוא נוגדן עצמי מרכזי בתהליך זה12,13. תפקידם של תאי CD4+T מווסתים (IL)-4-upregulated המזהים CYP2E1 שעבר שינוי לאחר תרגום וחלבוני כבד אחרים הוא יוזם מקובל של DIH בהרדמה על ידי משיכת נויטרופילים, אאוזינופילים ותאי תורן לתוך הכבד14, ומנגנון זה אושר בצורות רבות של DIH15,16. תאי CD4+CD25+T המושרים על ידי FoxP3 המבטאים את ה-FoxP3 מפחיתים את חומרת ה-DIH, וחסרים יחסיים של תאים אלה בטחול מחמירים את ה-DIH 10,7. לפיכך, רוב ההתקדמות בהבנת DIH התאפשרה על ידי שימוש במודלים של עכברים in vivo כדי להעריך את המנגנונים הגנטיים, המטבוליים והאימונולוגיים של DIH הן in vivo והן in vitro.
מכיוון שאנו וחוקרים אחרים גילינו תפקידים עבור IL-4, נויטרופילים ואאוזינופילים בייזום של DIH באמצעות מודלים שונים של עכברים, אנו מאמינים כי תצפית זו תומכת בטענתנו כי ללא קשר למודל ה-DIH שבו נעשה שימוש, הפטיטיס ופציעה נגרמות על ידי IL-4. כוחו של הפרוטוקול שלנו טמון בשימוש במתודולוגיית in vivo, הן עכברים זכרים והן נקבות, וחזרה על היסטולוגיה, מבחני התפשטות תאי T CD4+ T וציטוקינים. החוזק של השימוש שלנו במחקרים חוץ גופיים הוא שהם מפחיתים את מספר העכברים הדרושים תוך מתן המתודולוגיה לבידוד אינטראקציות תאיות המניעות DIH. אנו ממליצים על שימוש בעכברים זכרים ונקבות מכיוון שהדבר מקטין את האפשרות להטיה לא מודעת בפרשנות התוצאות ומחזק את פוטנציאל התרגום של המחקרים שלנו מכיוון שהשכיחות, השכיחות והחומרה של DIH גבוהות יותר אצל נשיםבנות 17. אנו ממליצים לקבל עכברים ממוכר יחיד; עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, השג פקדים על בני זוג פסולת או עכברים מסוג בר מאותו ספק כמו העכברים שהשתנו גנטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כוחו של פרוטוקול זה נשען על יכולת השכפול שלו; לכן, זה קריטי לדבוק בצעדים המוצעים. ניסוח של האימונוגן יכול להיות מחסום עבור חלק; עם זאת, שחזרנו את המודל שלנו באמצעות האפיטופ המתואר במסמך שלנו, אשר מסיר את הצורך לבודד את החלק S100 של הכבד. סביר להניח כי אפיטופים או חלבונים נוספים ניתן לשנות ולגרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד”ר נג’וקו מבקש להודות לד”ר נואל ר. רוז, MD PhD, על ההדרכה והדיונים מלאי התובנות שלו שהביאו לניסוח מודל זה.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
