Индукция лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита у мышей BALB/c для изучения его патогенных механизмов
Summary
Мы описываем in vivo иммунизацию, трансляционную модель гепатита у мышей BALB / c, которая может быть использована для изучения патогенеза аутоиммунного гепатита, вызванного лекарственными средствами, включая половые различия, наблюдаемые при этом заболевании. Мы опишем, как эта модель демонстрирует воспроизводимый анализ с использованием экспериментальных методов in vivo и in vitro.
Abstract
Медикаментозный аутоиммунный гепатит (DIH) является наиболее распространенным процессом гиперсенсибилизации печени, вызванным лекарственными средствами, наблюдаемым примерно у 9-12% пациентов с аутоиммунным гепатитом. Подавляющее большинство пациентов с DIH – женщины. Основные механизмы этих половых различий в распространенности неясны из-за нехватки животных моделей, которые имитируют болезни человека. Тем не менее, широко распространено мнение, что основные механизмы связаны с гаплотипами лейкоцитарного антигена человека и половыми гормонами. Напротив, используя модель мыши DIH, мы обнаружили, что IL-4 инициируют CD4 + Т-клетки, направленные против эпитопа цитохрома P450 2E1, индуцирует приток нейтрофилов, макрофагов и тучных клеток в печень самок мышей BALB / c. Используя эту модель, мы также показали, что IL-33-индуцированные FoxP3 + регуляторные Т-клетки обеспечивают защиту от DIH у самок и самцов мышей. Эта модель DIH индуцируется путем иммунизации мышей эпитопом CYP2E1, который был ковалентно изменен метаболитом лекарственного средства, который был связан с DIH. Этот эпитоп распознается пациентами с DIH. Наш метод индуцирует устойчивый и воспроизводимый гепатит и аутоантитела, которые могут быть использованы для изучения патогенеза DIH. В то время как исследования in vivo могут вызывать чрезмерную боль и дистресс у мышей при неправильном выполнении, преимущество модели in vivo заключается в способности оценивать патогенез заболевания у большого числа мышей. Кроме того, биологические эффекты измененных белков печени могут быть изучены с использованием инвазивных процедур. Добавление исследований in vitro к экспериментальной конструкции позволяет быстро повторять и механистически анализировать на клеточном уровне. Таким образом, мы продемонстрируем наш модельный протокол и то, как его можно использовать для изучения механизмов DIH in vivo и in vitro.
Introduction
Целью этого метода является описание мышиной модели лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита, который развивается in vivo, и демонстрация того, как его можно использовать для исследования молекулярной, иммунологической и генетической основы этого заболевания. Долгосрочная цель наших исследований состоит в том, чтобы выявить механизмы, ответственные за развитие хронического воспаления и повреждения печени, путем изучения DIH у восприимчивых пациентов. Заболевания печени и цирроз печени являются шестой наиболее распространенной причиной смерти у взрослых в возрасте от 25 до 64 лет. Идиосинкразический DILI, иногда называемый медикаментозным аутоиммунным гепатитом (DIH), является третьей наиболее распространенной причиной острой печеночной недостаточности в Соединенных Штатах. DIH является наиболее распространенным процессом гиперсенсибилизации печени, вызванным лекарственными средствами, наблюдаемым примерно у 9-12% пациентов с аутоиммунным гепатитом1. Подавляющее большинство пациентов с ДГК составляют женщины 2,3,4. Тип DIH развивается у восприимчивых людей после введения галогенированных летучих анестетиков, таких как изофлуран, севофлуран, десфлуран или галотан. Эти анестетики ковалентно связываются с белками печени с реактивными продуктами их метаболизма, создавая таким образом новые аутоантигены, способные вызывать аллергические или аутоиммунные реакции5.
Изучение патогенных механизмов, участвующих в разработке анестетика и любой формы DIH, ранее затруднялось отсутствием животной модели, которая близко имитирует индукцию заболевания человека. Мы разработали экспериментальную мышиную модель DIH с признаками, напоминающими иммуноопосредованный DILI у пациентов. Гепатит индуцируется иммунизацией одним из двух аутоантигенов, которые были ковалентно модифицированы метаболитом трифторацетилхлорида (TFA), который образуется после окислительного метаболизма анестетика ферментом цитохромом P450 2E1 (CYP2E1)5. Одним аутоантигеном является печеночная цитозольная фракция печени S100, которая представляет собой смесь нескольких белков6, а второй аутоантиген представляет собой эпитоп CYP2E1, который распознается сыворотками у пациентов с анестетиком иммуноопосредованным DILI7. Используя мышей BALB/c, которые относительно устойчивы к экспериментальному аутоиммунному гепатиту, мы отличаем нашу модель от S100-индуцированной модели иммунизации аутоиммунного гепатита у мышей C57Bl/6J8.
Из-за его разнообразных клинических проявлений DIH трудно изучать у пациентов. Трансляционные экспериментальные модели дают возможность оценить патогенез заболевания in vivo и in vitro. В настоящее время не существует других альтернативных методов индуцирования DIH, которые полностью исследуют адаптивные или врожденные иммунные реакции in vivo или in vitro без использования животных. Более того, поскольку трифторацетилирование S-100 или эпитопа CYP2E1, по-видимому, не производит раздражающего иммуногена, и мы индуцируем DIH путем иммунизации белками, измененными TFA, эти животные не будут получать эфир, любой галогенированный анестетик, барбитурат или алкоголь до иммунизации или других процедур, учитывая, что эти агенты могут изменить параметры, которые мы изучаем. Тем не менее, мы уменьшили использование наших мышей, используя компьютерное моделирование для подтверждения предпочтений связывания нашего обнаруженного эпитопа CYP2E19 и отразили человеческий DIH, связанный с женским полом, продемонстрировав, что у самок мышей BALB / c развивается более тяжелый DIH10.
Несмотря на разнообразные проявления DIH у пациентов и проблемы в изучении клинического заболевания, посттрансляционная модификация нативных белков метаболитами реактивных лекарственных средств является признанным ключевым механизмом в патогенезе DIH, который следует за галогенированными анестетиками11. Исследователи также признают, что CYP2E1 является основным аутоантигеном в этом процессе12,13. Роль интерлейкиновых (IL)-4-повышенных CD4+Т-клеток, которые распознают посттрансляционно модифицированный CYP2E1 и другие белки печени, является признанным инициатором анестезирующего DIH путем привлечения нейтрофилов, эозинофилов и тучных клеток в печень14, и этот механизм был подтвержден во многих формах DIH15,16. Индуцированные FoxP3-экспрессирующие CD4+CD25+Т-клетки (Tregs) снижают тяжесть DIH, а относительные недостатки этих клеток в селезенке ухудшают DIH 10,7. Таким образом, большинство достижений в понимании DIH стало возможным благодаря использованию моделей мышей in vivo для оценки генетических, метаболических и иммунологических механизмов DIH как in vivo, так и in vitro.
Поскольку мы и другие исследователи раскрыли роль IL-4, нейтрофилов и эозинофилов в инициировании DIH с использованием различных моделей мышей, мы считаем, что это наблюдение подтверждает наше утверждение о том, что независимо от используемой модели DIH, гепатит и травма индуцируются IL-4. Сила нашего протокола заключается в использовании методологии in vivo, как самцов, так и самок мышей, и повторении гистологии, анализов пролиферации CD4 + Т-клеток и цитокинов. Сила нашего использования исследований in vitro заключается в том, что они уменьшают количество необходимых мышей, обеспечивая методологию для изоляции клеточных взаимодействий, которые управляют DIH. Мы рекомендуем использовать самцов и самок мышей, потому что это снижает возможность бессознательной предвзятости в интерпретации результатов и усиливает переводческий потенциал наших исследований, поскольку заболеваемость, распространенность и тяжесть DIH выше у женщин17 лет. Мы рекомендуем, чтобы мыши были получены от одного поставщика; однако, если это невозможно, получите контроль над пометом или мышей дикого типа у того же поставщика, что и генетически измененные мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сила этого протокола заключается в его воспроизводимости; поэтому крайне важно придерживаться предложенных шагов. Формула иммуногена может быть барьером для некоторых; однако мы воспроизвели нашу модель, используя эпитоп, описанный в нашем документе, который устраняет необходимость …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д-р Нджоку хотел бы поблагодарить д-ра Ноэля Р. Роуза, доктора медицинских наук, за его руководство и проницательные дискуссии, которые привели к формулированию этой модели.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
