इसके रोगजनक तंत्र के अध्ययन के लिए बीएएलबी /सी चूहों में दवा-प्रेरित, ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस का प्रेरण
Summary
सी चूहों में एक इन विवो टीकाकरण, ट्रांसलेशनल हेपेटाइटिस मॉडल का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग इस बीमारी में देखे गए सेक्स अंतर सहित दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हम वर्णन करेंगे कि यह मॉडल विवो और इन विट्रो प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण कैसे प्रदर्शित करता है।
Abstract
दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस (डीआईएच) ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के लगभग 9 से 12% रोगियों में देखी जाने वाली सबसे आम यकृत दवा-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता प्रक्रिया है। डीआईएच के रोगियों में अधिकांश महिलाएं हैं। मानव रोग की नकल करने वाले पशु मॉडल की कमी के कारण प्रसार में इन सेक्स अंतरों के अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं हैं। फिर भी, अंतर्निहित तंत्र को व्यापक रूप से मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन हैप्लोटाइप और सेक्स हार्मोन से जुड़ा माना जाता है। इसके विपरीत, एक डीआईएच माउस मॉडल का उपयोग करके, हमने खुलासा किया है कि आईएल -4 ने साइटोक्रोम पी 450 2 ई 1 के एपिटोप के खिलाफ निर्देशित सीडी 4 + टी कोशिकाओं को महिला बीएएलबी / इस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने यह भी दिखाया है कि आईएल -33-प्रेरित फॉक्सपी 3 + नियामक टी कोशिकाएं मादा और पुरुष चूहों में डीआईएच के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करती हैं। यह डीआईएच मॉडल सीवाईपी 2 ई 1 के एपिटोप के साथ चूहों को प्रतिरक्षित करके प्रेरित होता है जिसे डीआईएच से जुड़े ड्रग मेटाबोलाइट के साथ सहसंयोजक रूप से बदल दिया गया है। यह एपिटोप डीआईएच वाले रोगियों द्वारा मान्यता प्राप्त है। हमारी विधि मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हेपेटाइटिस और ऑटोएंटिबॉडी को प्रेरित करती है जिसका उपयोग डीआईएच के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि विवो अध्ययन में अनुचित तरीके से किए जाने पर चूहों में अनुचित दर्द और संकट हो सकता है, इन विवो मॉडल का लाभ बड़ी संख्या में चूहों में बीमारी के रोगजनन का मूल्यांकन करने की क्षमता है। इसके अतिरिक्त, परिवर्तित यकृत प्रोटीन के जैविक प्रभावों का अध्ययन आक्रामक प्रक्रियाओं का उपयोग करके किया जा सकता है। प्रयोगात्मक डिजाइन में इन विट्रो अध्ययनों के अलावा एक सेलुलर स्तर पर तेजी से पुनरावृत्ति और यंत्रवत विश्लेषण की अनुमति देता है। इस प्रकार, हम अपने मॉडल प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करेंगे और इसका उपयोग विवो और डीआईएच के इन विट्रो तंत्र में अध्ययन करने के लिए कैसे किया जा सकता है।
Introduction
इस पद्धति का उद्देश्य दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के एक माउस मॉडल का वर्णन करना है जो विवो में विकसित होता है और यह प्रदर्शित करता है कि इस बीमारी के आणविक, प्रतिरक्षाविज्ञानी और आनुवंशिक आधार की जांच के लिए इसका उपयोग कैसे किया जा सकता है। हमारे अध्ययन का दीर्घकालिक उद्देश्य अतिसंवेदनशील रोगियों में डीआईएच का अध्ययन करके पुरानी जिगर की सूजन और चोट के विकास के लिए जिम्मेदार तंत्र को उजागर करना है। यकृत रोग और सिरोसिस 25 से 64 वर्ष की आयु के वयस्कों में मृत्यु का छठा सबसे आम कारण है। इडियोसिंक्रेटिक डीआईएलआई, जिसे कभी-कभी दवा-प्रेरित ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस (डीआईएच) के रूप में जाना जाता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में तीव्र यकृत विफलता का तीसरा सबसे आम कारण है। डीआईएच ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस1 के लगभग 9 से 12% रोगियों में देखी जाने वाली सबसे आम यकृत दवा-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता प्रक्रिया है। डीआईएच के रोगियों में से अधिकांश महिलाएं 2,3,4 हैं। आइसोफ्लूरेन, सेवोफ्लुरेन, डेसफ्लुरेन या हेलोथेन जैसे हलोजनयुक्त वाष्पशील एनेस्थेटिक्स के प्रशासन के बाद अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में एक प्रकार का डीआईएच विकसित होता है। ये संवेदनाहारी सहसंयोजक रूप से अपने चयापचय के प्रतिक्रियाशील उत्पादों के साथ यकृत प्रोटीन को बांधती हैं, इस प्रकार एलर्जी या ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने में सक्षम उपन्यास ऑटोएंटिजन बनाती हैं5.
संवेदनाहारी और डीआईएच के किसी भी रूप के विकास में शामिल रोगजनक तंत्र का अध्ययन पहले एक पशु मॉडल की कमी से बाधित हुआ है जो मानव रोग के प्रेरण की बारीकी से नकल करता है। हमने रोगियों में प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले डीआईएलआई जैसी विशेषताओं के साथ डीआईएच का एक प्रायोगिक म्यूरिन मॉडल विकसित किया है। हेपेटाइटिस दो ऑटोएंटिजन में से एक के साथ टीकाकरण से प्रेरित होता है जिसे ट्राइफ्लोरोसेटाइल क्लोराइड (टीएफए) मेटाबोलाइट द्वारा सहसंयोजक रूप से संशोधित किया गया है जो एंजाइम साइटोक्रोम पी 450 2 ई 1 (सीवाईपी 2 ई 1) 5 द्वारा संवेदनाहारी के ऑक्सीडेटिव चयापचय के बाद बनता है। एक ऑटोएंटिजन यकृत साइटोसोलिक एस 100 यकृत अंश है, जो कई प्रोटीन6 का मिश्रण है, और दूसरा ऑटोएंटिजन सीवाईपी 2 ई 1 का एक एपिटोप है जिसे संवेदनाहारी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले डीआईएलआई7 वाले रोगियों से सीरा द्वारा मान्यता प्राप्त है। सी चूहों का उपयोग करके, जो प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं, हम अपने मॉडल को सी 57 बीएल / 6जे चूहों में ऑटोइम्यून हेपेटाइटिस के एस 100-प्रेरित टीकाकरण मॉडल से अलग करते हैं।
इसकी विविध नैदानिक प्रस्तुतियों के कारण, डीआईएच रोगियों में अध्ययन करना मुश्किल है। ट्रांसलेशनल प्रायोगिक मॉडल विवो और इन विट्रो में रोग के रोगजनन का मूल्यांकन करने की क्षमता प्रदान करते हैं। वर्तमान में, डीआईएच को प्रेरित करने के लिए कोई अन्य वैकल्पिक तरीके नहीं हैं जो जानवरों के उपयोग के बिना विवो या इन विट्रो अनुकूली या जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में पूरी तरह से जांच करते हैं। इसके अलावा, चूंकि एस -100 या सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप के ट्राइफ्लोरोएसिटाइलेशन एक परेशान इम्युनोजेन का उत्पादन नहीं करते हैं, और हम टीएफए-परिवर्तित प्रोटीन के साथ टीकाकरण द्वारा डीआईएच को प्रेरित कर रहे हैं, इन जानवरों को टीकाकरण या अन्य प्रक्रियाओं से पहले ईथर, किसी भी हलोजनयुक्त संवेदनाहारी, बार्बिटुरेट या अल्कोहल प्राप्त नहीं होगा, यह देखते हुए कि ये एजेंट हमारे द्वारा अध्ययन किए जा रहे मापदंडों को बदल सकते हैं। फिर भी, हमने अपने खोजे गए सीवाईपी 2 ई 1 एपिटोप9 की बाध्यकारी वरीयताओं की पुष्टि करने के लिए कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग करके अपने माउस उपयोग को कम करदिया है और मानव डीआईएच को प्रतिबिंबित किया है जो महिला सेक्स को दर्शाता है कि मादा बीएएलबी /
रोगियों में डीआईएच की विविध प्रस्तुतियों और नैदानिक रोग के अध्ययन में चुनौतियों के बावजूद, प्रतिक्रियाशील दवा चयापचयों द्वारा देशी प्रोटीन का पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन रोगजनन डीआईएच में एक स्वीकृत महत्वपूर्ण तंत्र है जो हलोजनयुक्त संवेदनाहारी11 का अनुसरण करता है। जांचकर्ता यह भी स्वीकार करते हैं कि सीवाईपी 2 ई 1 इस प्रक्रिया में एक प्रमुख ऑटोएंटिजनहै 12,13। इंटरल्यूकिन (आईएल) -4-अपग्रेडेड सीडी 4 + टी कोशिकाओं की भूमिका जो पोस्ट-ट्रांसलेशनली संशोधित सीवाईपी 2 ई 1 और अन्य यकृत प्रोटीन को पहचानती है, यकृत14 में न्यूट्रोफिल, ईोसिनोफिल और मस्तूल कोशिकाओं को आकर्षित करके संवेदनाहारी डीआईएच का एक स्वीकृत सर्जक है, और इस तंत्र की पुष्टि डीआईएच15,16 के कई रूपों में की गई है। प्रेरित फॉक्सपी 3-व्यक्त सीडी 4 + सीडी 25 + टी कोशिकाएं (ट्रेग्स) डीआईएच की गंभीरता को कम करती हैं, और प्लीहा में इन कोशिकाओं की सापेक्ष कमियां डीआईएच 10,7 को खराब करती हैं। इस प्रकार, डीआईएच को समझने में अधिकांश प्रगति विवो और इन विट्रो दोनों में डीआईएच के आनुवंशिक, चयापचय और इम्यूनोलॉजिकल तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए विवो माउस मॉडल में उपयोग करके संभव बनाई गई है।
क्योंकि हमने और अन्य जांचकर्ताओं ने विभिन्न माउस मॉडल का उपयोग करके डीआईएच की दीक्षा में आईएल -4, न्यूट्रोफिल और ईोसिनोफिल के लिए भूमिकाओं को उजागर किया है, हम मानते हैं कि यह अवलोकन हमारे विवाद का समर्थन करता है कि उपयोग किए गए डीआईएच मॉडल की परवाह किए बिना, हेपेटाइटिस और चोट आईएल -4 से प्रेरित होती है। हमारे प्रोटोकॉल की ताकत विवो पद्धति में, नर और मादा चूहों दोनों के उपयोग में निहित है, और ऊतक विज्ञान, सीडी 4 + टी सेल प्रसार परख और साइटोकिन्स की पुनरावृत्ति। इन विट्रो अध्ययनों के हमारे उपयोग की ताकत यह है कि वे डीआईएच को चलाने वाले सेलुलर इंटरैक्शन को अलग करने के लिए पद्धति प्रदान करते समय आवश्यक चूहों की संख्या को कम करते हैं। हम नर और मादा चूहों के उपयोग की सलाह देते हैं क्योंकि यह परिणामों की व्याख्या में बेहोश पूर्वाग्रह की संभावना को कम करता है और हमारे अध्ययन की अनुवाद क्षमता को मजबूत करता है क्योंकि डीआईएच की घटना, प्रसार और गंभीरता महिलाओं में अधिक है17. हम अनुशंसा करते हैं कि चूहों को एक ही विक्रेता से प्राप्त किया जाता है; हालाँकि, यदि यह संभव नहीं है, तो आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के समान विक्रेता से कूड़े के साथी नियंत्रण या जंगली प्रकार के चूहों को प्राप्त करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की ताकत इसकी प्रजनन क्षमता में टिकी हुई है; इसलिए, सुझाए गए चरणों का पालन करना महत्वपूर्ण है। इम्यूनोजेन का निर्माण कुछ के लिए एक बाधा हो सकता है; हालाँकि, हमने अपने दस्तावेज़ में वर्णित एप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नोएल आर रोज, एमडी पीएचडी को उनके मार्गदर्शन और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए स्वीकार करना चाहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप इस मॉडल का निर्माण हुआ।
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
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