Induksjon av legemiddelindusert, autoimmun hepatitt hos BALB/c mus for studier av dets patogene mekanismer
Summary
Vi beskriver en in vivo immunisering, translasjonell hepatittmodell i BALB / c mus som kan brukes til å studere patogenesen av legemiddelindusert autoimmun hepatitt inkludert kjønnsforskjeller sett i denne sykdommen. Vi vil beskrive hvordan denne modellen demonstrerer reproduserbare analyser ved hjelp av in vivo og in vitro eksperimentelle teknikker.
Abstract
Legemiddelindusert autoimmun hepatitt (DIH) er den vanligste hepatiske legemiddelinduserte hypersensibiliseringsprosessen observert hos ca. 9 til 12% av pasientene med autoimmun hepatitt. Det overveldende flertallet av pasienter med DIH er kvinner. De underliggende mekanismene for disse kjønnsforskjellene i prevalens er uklare på grunn av mangelen på dyremodeller som etterligner menneskelig sykdom. Likevel er underliggende mekanismer allment antatt å være assosiert med humane leukocyttantigen haplotyper og kjønnshormoner. I motsetning til dette har vi ved hjelp av en DIH-musemodell avdekket at IL-4 initierte CD4 + T-celler rettet mot en epitop av cytokrom P450 2E1 induserer tilstrømning av nøytrofiler, makrofager og mastceller i leveren til kvinnelige BALB / c-mus. Ved hjelp av denne modellen har vi også vist at IL-33-induserte FoxP3 + regulatoriske T-celler gir beskyttelse mot DIH hos kvinnelige og mannlige mus. Denne DIH-modellen induseres ved immunisering av mus med en CYP2E1-epitop som har blitt kovalent endret med en legemiddelmetabolitt som har vært assosiert med DIH. Denne epitopen er anerkjent av pasienter med DIH. Vår metode induserer robust og reproduserbar hepatitt og autoantistoffer som kan brukes til å studere patogenesen til DIH. Mens in vivo-studier kan forårsake unødig smerte og nød hos mus når det gjøres feil, er fordelen med en in vivo-modell evnen til å evaluere patogenesen av sykdom hos et stort antall mus. I tillegg kan biologiske effekter av de endrede leverproteinene studeres ved hjelp av invasive prosedyrer. Tillegg av in vitro-studier til eksperimentell design tillater rask repetisjon og mekanistisk analyse på mobilnivå. Dermed vil vi demonstrere vår modellprotokoll og hvordan den kan brukes til å studere in vivo og in vitro mekanismer av DIH.
Introduction
Formålet med denne metoden er å beskrive en musemodell av medikamentindusert autoimmun hepatitt som utvikler seg in vivo og demonstrere hvordan den kan brukes til å undersøke det molekylære, immunologiske og genetiske grunnlaget for denne sykdommen. Det langsiktige målet med våre studier er å avdekke mekanismer som er ansvarlige for utvikling av kronisk leverbetennelse og skade ved å studere DIH hos følsomme pasienter. Leversykdom og skrumplever utgjør den sjette vanligste dødsårsaken hos voksne mellom 25 og 64 år. Idiosynkratisk DILI, noen ganger referert til som legemiddelindusert autoimmun hepatitt (DIH), er den tredje vanligste årsaken til akutt leversvikt i USA. DIH er den vanligste hepatiske legemiddelinduserte hypersensibiliseringsprosessen observert hos ca. 9 til 12 % av pasientene med autoimmun hepatitt1. Det overveldende flertallet av pasienter med DIH er kvinner 2,3,4. En type DIH utvikles hos følsomme individer etter administrering av halogenerte flyktige anestetika som isofluran, sevofluran, desfluran eller halotan. Disse anestetika binder kovalent til leverproteiner med reaktive produkter av deres metabolisme, og skaper dermed nye autoantigener som er i stand til å fremkalle allergiske eller autoimmune responser.
Studien av patogene mekanismer involvert i utviklingen av bedøvelse og enhver form for DIH har tidligere blitt hindret av mangelen på en dyremodell som nøye etterligner induksjonen av menneskelig sykdom. Vi har utviklet en eksperimentell murine modell av DIH med funksjoner som ligner immunmediert DILI hos pasienter. Hepatitt induseres ved immunisering med ett av to autoantigener som er kovalent modifisert av trifluoroacetylklorid (TFA)-metabolitten som dannes etter oksidativ metabolisme av bedøvelsen av enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Ett autoantigen er den hepatiske cytosoliske S100 leverfraksjonen, som er en blanding av flere proteiner6, og det andre autoantigenet er en epitop av CYP2E1 som gjenkjennes av sera fra pasienter med bedøvelse immunmediert DILI7. Ved å bruke BALB/c mus, som er relativt resistente mot eksperimentell autoimmun hepatitt, skiller vi vår modell fra den S100-induserte immuniseringsmodellen for autoimmun hepatitt hos C57Bl/6J mus8.
På grunn av sine mangfoldige kliniske presentasjoner er DIH vanskelig å studere hos pasienter. Translasjonelle eksperimentelle modeller gir muligheten til å evaluere patogenesen av sykdom in vivo og in vitro. For tiden finnes det ingen andre alternative metoder for å indusere DIH som fullt ut undersøker in vivo eller in vitro adaptive eller medfødte immunresponser uten bruk av dyr. Videre, siden trifluoroacetylering av S-100 eller CYP2E1 epitopen ikke ser ut til å produsere et irriterende immunogen, og vi induserer DIH ved immunisering med TFA-endrede proteiner, vil disse dyrene ikke motta eter, noe halogenert bedøvelsesmiddel, barbiturat eller alkohol før immunisering eller andre prosedyrer, med tanke på at disse midlene kan endre parametrene vi studerer. Likevel har vi redusert musebruken vår ved å bruke datasimulering for å bekrefte bindingspreferansene til vår oppdagede CYP2E1 epitop9 og har speilet menneskelig DIH som impliserer kvinnelig kjønn ved å demonstrere at kvinnelige BALB / c-mus utvikler en mer alvorlig DIH10.
Til tross for ulike presentasjoner av DIH hos pasienter og utfordringer i studiet av klinisk sykdom, er posttranslasjonell modifikasjon av innfødte proteiner ved reaktive legemiddelmetabolitter en akseptert nøkkelmekanisme i patogenesen DIH som følger halogenerte anestetika11. Etterforskerne aksepterer også at CYP2E1 er et viktig autoantigen i denne prosessen12,13. Rollen til interleukin (IL)-4-oppregulerte CD4+T-celler som gjenkjenner et posttranslasjonelt modifisert CYP2E1 og andre leverproteiner er en akseptert initiator av bedøvelses-DIH ved å tiltrekke nøytrofiler, eosinofiler og mastceller inn i leveren14, og denne mekanismen er bekreftet i mange former for DIH15,16. Induserte FoxP3-uttrykkende CD4+ CD25 + T-celler (Tregs) reduserer alvorlighetsgraden av DIH, og relative mangler av disse cellene i milten forverrer DIH 10,7. Dermed har de fleste fremskritt i forståelsen av DIH blitt gjort mulig ved å bruke in vivo musemodeller for å evaluere de genetiske, metabolske og immunologiske mekanismene til DIH både in vivo og in vitro.
Fordi vi og andre etterforskere har avdekket roller for IL-4, nøytrofiler og eosinofiler i initiering av DIH ved hjelp av forskjellige musemodeller, tror vi at denne observasjonen støtter vår påstand om at uavhengig av DIH-modellen som brukes, er hepatitt og skade indusert av IL-4. Styrken i protokollen vår ligger i bruk av in vivo-metodikk, både hann- og hunnmus, og repetisjon av histologi, CD4+ T-celleproliferasjonsanalyser og cytokiner. Styrken ved vår bruk av in vitro-studier er at de reduserer antall mus som trengs, samtidig som de gir metodikken for å isolere cellulære interaksjoner som driver DIH. Vi anbefaler bruk av hann- og hunnmus fordi dette reduserer muligheten for ubevisst skjevhet i tolkningen av resultater og styrker oversettelsespotensialet i våre studier siden forekomsten, prevalensen og alvorlighetsgraden av DIH er høyere hos kvinner17. Vi anbefaler at mus hentes fra en enkelt leverandør; Men hvis dette ikke er mulig, få kullkompiskontroller eller villtypemus fra samme leverandør som de genetisk endrede musene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Styrken til denne protokollen hviler i dens reproduserbarhet; så det er viktig å følge de foreslåtte trinnene. Formulering av immunogen kan være en barriere for noen; Vi har imidlertid reprodusert modellen vår ved hjelp av epitopen beskrevet i vårt dokument, noe som fjerner behovet for å isolere S100-fraksjonen av leveren. Det er sannsynlig at ytterligere epitoper eller proteiner kan endres og indusere hepatitt etter vaksinasjoner; Vi beskriver imidlertid de proteinene vi har brukt med pålitelige resultater. Fle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Njoku vil gjerne anerkjenne Dr. Noel R. Rose, MD PhD, for hans veiledning og innsiktsfulle diskusjoner som resulterte i formuleringen av denne modellen.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
