Vi presenterer eksperimentelle metoder for studere RNA-interaktører av double-strandet RNA bindende protein kinase RNA-aktivert (PKR) under pattedyr cellen syklus bruker HeLa celler. Denne metoden bruker formaldehyd krysskobling RNA-PKR komplekser og immunoprecipitation å berike PKR-bundet RNAs. Disse RNAs kan analyseres videre gjennom høy gjennomstrømming sekvensering eller qRT PCR.
Protein kinase RNA-aktivert (PKR) er medlem av medfødte immunforsvaret proteiner og gjenkjenner double-strandet sekundære strukturen i viral RNAs. Når bundet til viral double-strandet RNAs (dsRNAs), gjennomgår PKR dimerization og senere autophosphorylation. Fosforylert PKR (pPKR) blir aktivt og induserer fosforylering av alpha delenhet i eukaryote initiering faktor 2 (eIF2α) å undertrykke global oversettelse. Økende bevis antyder at PKR kan aktiveres under fysiologiske forhold som under cellen syklus eller ulike stress forhold uten smitte. Men er vår forståelse av RNA aktivator av PKR begrenset på grunn av mangel på en standardisert eksperimentell metode for å fange og analysere PKR-samspill dsRNAs. Her presenterer vi en eksperimentell protokoll spesielt berike og analysere PKR bundet RNAs under cellen syklus bruker HeLa celler. Vi benytter effektiv crosslinking aktiviteten av formaldehyd å fikse PKR-RNA komplekser og isolere dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kan deretter bearbeides videre for å generere en høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek. En stor klasse av PKR-samspill mobilnettet dsRNAs er mitokondrie RNAs (mtRNAs), som kan forekomme som intermolekylære dsRNAs gjennom komplementære samhandling mellom den tunge-stranden og lys-strand-RNAs. For å studere strandedness av disse dupleks mtRNAs, presenterer vi også en protokoll for strand-spesifikke qRT PCR. Våre protokollen er optimalisert for analyse av PKR-bundet RNAs, men den kan enkelt endres for å studere mobilnettet dsRNAs eller RNA-interaktører andre dsRNA binding proteiner.
Protein kinase RNA-aktivert (PKR), også kjent som eukaryote initiering faktor 2-alfa kinase 2 (EIF2AK2), er et godt karakterisert protein kinase som overfører informasjonen fra RNAs. Den tilhører den eukaryote oversettelse innvielse 2 delenhet alpha (eIF2α) kinase familie og phosphorylates eIF2α på serine 51 i respons på infeksjon å undertrykke global oversettelsesbyrå1. I denne sammenheng aktiveres PKR viral double-strandet RNAs (dsRNAs), som gir en plattform for PKR dimerization og autophosphorylation2. I tillegg til eIF2α, kan PKR også phosphorylate p53, insulin receptor substrat 1, hemmer κB og c-Jun N-terminal kinase (JNK) for å regulere aktiviteten av mange signal signaltransduksjon trasé3,4,5, 6.
PKR ble opprinnelig identifisert som en kinase som fosforylert eIF2α under poliovirus infeksjon ved å anerkjenne poliovirus’ dsRNAs7,8. PKR finnes stadig for å spille mangefasettert roller utover immunrespons og dens avvikende aktivisering eller feil er underforstått i mange menneskelige sykdommer. Aktivert/Phosphorylated PKR (pPKR) er ofte observert under apoptose og er et vanlig kjennetegn på pasienter med degenerative sykdommen, særlig nevrodegenerative sykdommer som Huntingtons, Parkinsons og Alzheimers sykdom9 ,10,11,12,13. I tillegg aktiveres PKR under ulike stress forhold som metabolske stress og varme sjokk14,15,16,17. På den annen side, resulterer hemming av PKR i økt celle spredning og selv malign transformasjon18,19. PKR-funksjonen er også viktig i normal hjernefunksjon og under cellen syklus som pPKR er opphøyet i løpet av M fase20,21,22. I denne sammenheng pPKR undertrykker global oversettelsesbyrå og gir signaler til viktige mitotisk signalnettverk systemer som kreves for riktig celledeling20. Videre resulterte langvarig aktivering av PKR i G2/M fase celle syklus arrestasjon i kinesisk hamster eggstokk celler23. Følgelig er PKR fosforylering regulert av negativ feedback loop å sikre rask deaktivering i M/G1 overgang21.
Funksjonen bredt spekter av PKR er vår forståelse av PKR aktivisering begrenset på grunn av mangel på en standardisert høy gjennomstrømming eksperimentelle tilnærming til fange og identifisere dsRNAs som kan aktivere PKR. Tidligere studier har vist at PKR samvirke med dsRNAs dannet av to invertert Alu gjentar (IRAlus)20,24, men muligheten for eksistensen av flere mobilnettet dsRNAs som kan aktivere PKR under cellen syklus eller under stress forhold i menneskeceller var uutforsket. Konvensjonelle tilnærming identifisere RNA-interaktører en RNA bindende protein (RBP) bruker UV-lys til krysskobling RNA-RBP komplekser25,26,27. En fersk studie brukt denne UV crosslinking i en mus system og identifisert at små nucleolar RNAs kan regulere PKR aktivisering under metabolske stress16. Ved å benytte høy crosslinking effektiviteten av formaldehyd, presenterte vi en alternativ metode for å identifisere PKR-samspill RNAs under cellen syklus i HeLa celler28. En lignende fremgangsmåte er brukt for å studere andre dsRBPs som Staufen og Drosha29,30,31. Vi fant at PKR samvirke med ulike typer noncoding RNAs som kort avbrutt kjernefysiske element (SINE), lang ispedd kjernefysiske element (linje) og endogene retrovirus element (ERV) med alpha-satellitt RNAs. I tillegg viste vi at PKR samvirke med mitokondrie RNAs (mtRNAs), hvilke form intermolekylære dsRNAs gjennom komplementære samhandling mellom den tunge-stranden og lyset tråd RNAs28. En fersk publikasjon støttes videre våre data at noen mtRNAs finnes i en dupleks-skjemaet og kan aktivere dsRNA sensorer som melanom differensiering-assosiert protein 5 å indusere interferoner32. Enda viktigere, er uttrykk og subcellular lokalisering av mtRNAs modulert under cellen syklus og ulike stressorer, som kan være viktige i å regulere PKR aktivisering28.
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for en nylig utviklet formaldehyd crosslinking og immunoprecipitation (fCLIP) metode for å fange og analysere PKR-samspill RNAs under cellen syklus. Vi viser metoden for å forberede celle syklus arrestasjon prøver ved thymidine og nocodazole. Deretter presenterer vi fCLIP prosessen å isolere PKR-bundet RNAs og en metode for å forberede høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek for å identifisere disse RNAs. Videre avgrense vi detaljerte prosedyrer for å analysere PKR-bundet RNAs bruker qRT PCR. Spesielt, presenterer vi en strand-spesifikke omvendt transkripsjon prosedyre for å analysere strandedness for mtRNAs. Beskrevet protokollen er optimalisert for HeLa celler og PKR, men viktige trinn som utarbeidelse av cellen syklus utvalg, fCLIP og strand-spesifikke qRT PCR analyse kan enkelt endres studere mobilnettet dsRNAs eller identifisere RNA interaktører av andre dsRBPs.
Prosessen å forberede S eller M fase-arrestert prøver er illustrert i figur 1. For å arrestere celler på S fasen, brukte vi en thymidine dobbelt blokk metode der vi behandlet celler med thymidine to ganger med en 9 h utgivelse i mellom å sikre høy arrestasjonen effektivitet (figur 1A). M fase arrestasjon, vi behandlet celler når med thymidine etterfulgt av en 9 h utgivelse og deretter brukt nocodazole blokk cellene på prometaphase (f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av grunnleggende Science Research Program gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av koreanske regjeringen departementet for vitenskap og IKT (NRF-2016R1C1B2009886).
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
Anti-DGCR8 | Made in house | ||
Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
Formamide | Merck | 104008 | |
Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
Triton X-100 | Promega | H5142 | |
Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
Ultrasonicator | Bioruptor | ||
Urea | Bio-basic | UB0148 | |
Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |