3D-analyse av multi-Cellular Svar å Chemoattractant graderinger
Summary
Vi beskriver en metode for å konstruere enheter for 3D-kultur og eksperimentering med celler og flercellede organoids. Denne enheten tillater analyse av cellulære reaksjoner på oppløselige signaler i 3D-microenvironments med definerte chemoattractant graderinger. Organoids er bedre enn enkeltceller ved påvisning av svake støyende innganger.
Abstract
Ulike begrensninger av 2D cellekultur systemer har skapt interesse for 3D cellekultur og analyse plattformer, noe som ville bedre etterligne den romlige og kjemiske kompleksiteten av levende vev og etterligne in vivo vev funksjoner. Nylige fremskritt innen microfabrication teknologi har gjort det mulig å utvikle 3D in vitro-miljøer der celler kan integreres i en veldefinert ekstracellulære matrise (ECM) og et definert sett med oppløselige eller Matrix-tilknyttede biomolekyler. Teknologiske barrierer har imidlertid begrenset sin utbredte bruk i forskningslaboratorier. Her beskriver vi en metode for å konstruere enkle enheter for 3D-kultur og eksperimentering med celler og flercellede organoids i 3D-microenvironments med en definert chemoattractant gradering. Vi illustrerer bruken av denne plattformen for analyse av responsen av epitelceller og organoids til graderinger av vekstfaktorer, slik som epidermal vekstfaktor (EGF). EGF graderinger var stabile i enhetene i flere dager fører til rettet gren dannelse i bryst organoids. Denne analysen tillot oss å konkludere med at kollektive gradient sensing av grupper av celler er mer følsom kontra enkeltceller. Vi beskriver også fabrikasjon metoden, som ikke krever Foto litografi fasiliteter eller avanserte myke litografi teknikker. Denne metoden vil være nyttig å studere 3D cellulære atferd i sammenheng med analyse av utvikling og patologiske tilstander, inkludert kreft.
Introduction
I fysiologiske miljø, er celler innebygd i en ekstracellulære matrise (ECM) og utsatt for en overflod av biomolekyler. Interaksjoner mellom celler og de omkringliggende mikromiljøet regulerer intracellulære prosesser som kontrollerer ulike fenotyper, inkludert migrasjon, vekst, differensiering og overlevelse1,2. Mye har lært om mobilnettet atferd i en konvensjonell 2D cellekultur. Men med bruk av intravital Imaging og eksperimentering med celler innebygd i 3D-hydrogeler, viktige forskjeller i celle atferd har blitt anerkjent i forenklet 2D in vitro kulturer g. 3D vev-lignende miljøer. Mens cellene samhandler med ECM-fibre og føler sine mekaniske egenskaper i 3D-matrisen, er ikke materialets stivhet en helt uavhengig variabel i et 2D in vitro-system. Dimensionality endrer fokus vedheft formasjon, noe som resulterer i ulike celle morfologi og atferd. I tillegg blir celler på en 2D-overflate utsatt for færre signal signaler enn celler som er åpne for alle retninger i 3D.
Disse begrensningene har økt interessene for 3D-systemer som representerer den romlige og kjemiske kompleksiteten av levende vev og bedre forutsi in vivo vev funksjoner. De har blitt utviklet i mange former fra organoids som selv-montering Cellular mikrostrukturen til celler tilfeldig ispedd i ECM3,4. Nylige fremskritt innen microfabrication teknologi har muliggjort bruk av ulike typer 3D-kultur systemer5,6,7,8,9 for å studere fenotypiske endringer og cellulære reaksjoner på oppløselige signaler; teknologiske barrierer begrenser imidlertid utbredt bruk i forskningslaboratorier. I mange tilfeller, fabrikasjon prosesser forlange Foto litografi teknikker og miljøet kunnskaper for bløt litografi. Videre må ulike faktorer styres for å kunne bygge en enhet og for å oppnå en optimal funksjon av enheten over en lang tidsperiode.
Vår metode beskriver hvordan å konstruere en 3D PDMS enhet for å innlemme celler og flercellede organoids inn i en 3D mikromiljøet med definerte chemoattractant graderinger og deretter analysere epitel responser til EGF10. Våre data viser at kapasiteten til organoids å reagere på grunne EGF graderinger oppstår fra intercellulære kjemisk kopling gjennom gap knutepunkter. Det tyder på potensialet i organoids for mer presis påvisning av svake og støyende romlig gradert innganger. Det fabrikasjon forarbeide er ikke forlange en renrom Letter heller ikke Foto litografi teknikker. 3D PDMS-enheten inneholder imidlertid de nødvendige faktorene for 3D-fysiologisk miljø. Denne metoden vil være nyttig å studere 3D mobilnettet atferd og det har stor forskning potensial med ulike celletyper, chemoattractants, og ECM kombinasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabrikasjon av PDMS muggsopp ble utført ved hjelp av en kommersiell 3D-utskrift service, men kan også oppnås ved en high end 3D-skriver i huset. Blant forskjellige 3D fabrikasjon metoder, Stereolithography anbefales for høy resolution mold generasjon. Fordi PDMS herding oppstår ved høy temperatur (80 ° c), bør materialene være tilstrekkelig termisk motstandsdyktig, noe som bør være eksplisitt spesifisert, Hvis utskriften er outsourcet. En termisk post-kur kan diskuteres med trykkeriet selskapet å øke termisk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), og NCI U54 CA210173) og AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
