Chemoattractant Gradients के लिए बहु सेलुलर प्रतिक्रियाओं का 3 डी विश्लेषण
Summary
हम कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉयड के साथ 3 डी संस्कृति और प्रयोग के लिए उपकरणों का निर्माण करने के लिए एक विधि का वर्णन । इस उपकरण को परिभाषित chemoattractant gradients के साथ 3 डी microपरिवेशों में घुलनशील संकेतों को सेलुलर प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है । ऑर्गेनॉयड कमजोर शोर आदानों का पता लगाने में एकल कोशिकाओं की तुलना में बेहतर कर रहे हैं ।
Abstract
2D कोशिका संस्कृति प्रणाली की विभिंन सीमाओं 3 डी कोशिका संस्कृति और विश्लेषण प्लेटफार्मों, जो बेहतर रहने वाले ऊतकों और vivo में ऊतक कार्यों में नकल की स्थानिक और रासायनिक जटिलता की नकल होगी में रुचि छिड़ गई है । माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों में 3 डी के विट्रो वातावरण में जो कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से परिभाषित extracellular मैट्रिक्स (ECM) में एकीकृत किया जा सकता है और घुलनशील या मैट्रिक्स जुड़े biomolecules का एक निर्धारित सेट के विकास को सुगम बनाया है । तथापि, प्रौद्योगिकीय अवरोधों ने अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उनके व्यापक उपयोग को सीमित कर दिया है । यहाँ, हम एक परिभाषित chemoattractant ढाल के साथ 3 डी माइक्रोवातावरणों में कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉयड के साथ 3 डी संस्कृति और प्रयोग के लिए सरल उपकरणों का निर्माण करने के लिए एक विधि का वर्णन । हम एपिथेलियल कोशिकाओं और ऑर्गेनॉइड की प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए इस मंच के उपयोग की व्याख्या करने के लिए वृद्धि कारकों के gradients, ऐसे एपिडर्मल विकास कारक (egf) के रूप में । EGF gradients कई दिनों के लिए उपकरणों में स्थिर थे स्तन ऑर्गेनॉइड में निर्देशित शाखा गठन के लिए अग्रणी । इस विश्लेषण ने हमें यह निष्कर्ष निकालना था कि कोशिकाओं के समूह द्वारा सामूहिक प्रवणता संवेदन एकल कोशिकाओं बनाम अधिक संवेदनशील होती है । हम भी निर्माण विधि है, जो photolithography सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है और न ही उंनत शीतल लिथोग्राफी तकनीकों का वर्णन । इस पद्धति के कैंसर सहित विकास और रोग राज्यों के विश्लेषण के संदर्भ में 3 डी सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
शरीरक्रियात्मक वातावरण में कोशिकाएं कोशिकाबाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में समाहित हो जाती हैं और ढेर सारे जैव अणुओं के संपर्क में आ जाती हैं । कोशिकाओं और आसपास के microenvironment के बीच पारस्परिक क्रिया को विनियमित intracellular विभिंन phenotypes को नियंत्रित करने, प्रवास, विकास, भेदभाव और अस्तित्व1,2सहित प्रक्रियाओं । बहुत सेलुलर व्यवहार के बारे में एक पारंपरिक 2 डी कोशिका संस्कृति में सीखा गया है । हालांकि, intravital इमेजिंग और 3 डी hydrogels में एंबेडेड कोशिकाओं के साथ प्रयोग के आगमन के साथ, सेल व्यवहार में महत्वपूर्ण अंतर सरलीकृत 2D में विट्रो संस्कृतियों बनाम 3D ऊतक वातावरण की तरह में मांयता प्राप्त किया गया है । जबकि कोशिकाओं ECM फाइबर के साथ बातचीत और 3 डी मैट्रिक्स के भीतर अपने यांत्रिक गुणों भावना, जेल की सामग्री कठोरता एक 2D में विट्रो प्रणाली में एक पूरी तरह से स्वतंत्र चर नहीं है । विमीयता आसंजन गठन के फोकल बदल, विभिंन कोशिका आकारिकी और व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, एक 2D सतह पर कोशिकाओं को 3 डी में सभी दिशाओं के लिए खुला से कम संकेतन cues को उजागर कर रहे हैं ।
इन सीमाओं 3 डी प्रणाली है कि रहने वाले ऊतकों की स्थानिक और रासायनिक जटिलता का प्रतिनिधित्व करते है और बेहतर vivo ऊतक कार्यों में भविष्यवाणी के लिए हितों में वृद्धि हुई है । वे स्वतः ecm3,4में interspersed कोशिकाओं को सेलुलर microstructures कोडांतरण के रूप में ऑर्गेनॉइड से कई रूपों में विकसित किया गया है । माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों 3 डी संस्कृति प्रणालियों के विभिन्न प्रकार के आगमन की सुविधा है5,6,7,8,9 लक्षणप्ररूपी परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए और घुलनशील संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाएं; तथापि, प्रौद्योगिकीय बाधाएं अनुसंधान प्रयोगशालाओं में व्यापक उपयोग को सीमित करती हैं । कई मामलों में, निर्माण प्रक्रियाओं photolithography तकनीकों और नरम लिथोग्राफी के लिए पृष्ठभूमि knowledges की आवश्यकता है । इसके अलावा, विभिन्न कारकों को सफलतापूर्वक एक डिवाइस का निर्माण करने के लिए और समय की एक लंबी अवधि में डिवाइस के एक इष्टतम समारोह को प्राप्त करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए.
हमारी विधि का वर्णन कैसे परिभाषित chemoattractant gradients के साथ एक 3 डी microenvironment में कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉइड को शामिल करने के लिए एक 3 डी pdms उपकरण का निर्माण करने के लिए और फिर egf10के लिए उपकला प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण । हमारे आंकड़ों से पता चलता है कि उथले EGF ग्रेडिएंट्स का जवाब देने के लिए ऑर्गेनॉइड की क्षमता अंतर जंक्शनों के माध्यम से अंतरकोशिकीय रासायनिक युग्मन से पैदा होती है । यह कमजोर और शोर वाले स्पैटीली वर्गीकृत आदानों का अधिक सटीक पता लगाने के लिए ऑर्गेनॉइड की क्षमता का सुझाव देता है । निर्माण प्रक्रिया के लिए एक cleanroom सुविधा और न ही photolithography तकनीक की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, 3 डी PDMS डिवाइस 3 डी शारीरिक वातावरण के आवश्यक कारक भी शामिल है । इस विधि 3 डी सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा और यह विभिन्न प्रकार के सेल के साथ महान अनुसंधान की क्षमता है, chemoattractants, और ECM संयोजन.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS molds के निर्माण एक वाणिज्यिक 3 डी मुद्रण सेवा का उपयोग किया गया था, लेकिन यह भी एक उच्च अंत में 3 डी प्रिंटर घर से पूरा किया जा सकता है । विभिंन 3d निर्माण तरीकों में, स्टीरियोलिथोग्राफी उच्च संकल्प मोल्ड पी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम AJE (NSF पीडी-11-7246, स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन (BCRF-17-048), और NCI U54 CA210173) और अल (U54CA209992) को अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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