استخدام في فيفو تسجيل واحد من الألياف والعقدة الجذر الرحالة سليمة مع العصب الوركي المرفقة لدراسة آلية فشل التوصيل
Summary
تسجيل الألياف الواحدة هو تقنية كهربائية فسيولوجية فعالة تنطبق على الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. جنبا إلى جنب مع إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة ، يتم فحص آلية فشل التوصيل. كلا البروتوكولين تحسين فهم علاقة الجهاز العصبي المحيطي مع الألم.
Abstract
كان تسجيل الألياف الواحدة تقنية كهرولوجية كلاسيكية وفعالة على مدى العقود القليلة الماضية بسبب تطبيقه المحدد للألياف العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تنطبق هذه الطريقة بشكل خاص على العقد الجذرية الظهرية (DRG)، وهي الخلايا العصبية الحسية الأولية التي تظهر بنية شبه أحادية القطب من العمليات العصبية. أنماط وملامح إمكانات العمل مرت على طول المحاور قابلة للتسجيل في هذه الخلايا العصبية. تستخدم هذه الدراسة في تسجيلات الألياف الواحدة في الجسم الحي لمراقبة فشل التوصيل للأعصاب الوركية في الفئران الكاملة التي تعالجها فريوند (CFA). كما لا يمكن دراسة الآلية الأساسية باستخدام في التسجيلات في الجسم الحي من الألياف الواحدة، يتم تنفيذ التصحيح المشبك التسجيلات من الخلايا العصبية DRG على الاستعدادات من DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة. تكشف هذه التسجيلات عن وجود ارتباط إيجابي بين فشل التوصيل والمنحدر الصاعد لإمكانات ما بعد فرط الاستقطاب (AHP) للخلايا العصبية DRG في الحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية. يسمح بروتوكول تسجيلات الألياف أحادية في الجسم الحي بتصنيف الألياف العصبية عن طريق قياس سرعة التوصيل ورصد الظروف غير الطبيعية في الألياف العصبية في بعض الأمراض. DRG سليمة مع العصب المحيطي المرفقة يسمح مراقبة نشاط الخلايا العصبية DRG في معظم الظروف الفسيولوجية. بشكل قاطع، تسجيل الألياف الواحدة جنبا إلى جنب مع تسجيل الكهرولوجية من DRGs سليمة هو وسيلة فعالة لدراسة دور فشل التوصيل أثناء عملية مسكن.
Introduction
يضمن الانتقال الطبيعي للمعلومات على طول الألياف العصبية الوظيفة الطبيعية للجهاز العصبي. وينعكس الأداء غير الطبيعي للجهاز العصبي أيضا في انتقال الإشارات الكهربائية للألياف العصبية. على سبيل المثال ، يمكن تصنيف درجة إزالة التمنة في آفات إزالة المليون المركزية من خلال مقارنة التغيرات في سرعة التوصيل العصبي قبل وبعد تطبيق التدخل1. من الصعب تسجيل الألياف العصبية داخل الخلايا، إلا في الاستعدادات الخاصة مثل محور الحبار العملاق أكسون2. ولذلك، فإن النشاط الكهرولوجيولوجي قابل للتسجيل فقط عن طريق التسجيل خارج الخلية للألياف واحدة. باعتبارها واحدة من الأساليب الكهرولوجية الكلاسيكية، تسجيل الألياف واحدة لديها تاريخ أطول من التقنيات الأخرى. ومع ذلك، فإن عدد أقل من علماء الفيزيولوجيا الكهربائية فهم هذه الطريقة على الرغم من تطبيقها على نطاق واسع. ولذلك، هناك حاجة إلى إدخال مفصل للبروتوكول القياسي لتسجيل الألياف الواحدة من أجل تطبيقه المناسب.
على الرغم من أن تقنيات التصحيح المشبك المختلفة هيمنت على الدراسة الكهرولوجية الحديثة، لا يزال تسجيل الألياف الواحدة يلعب دورا لا بديل له في تسجيل أنشطة الألياف العصبية، وخاصة الألياف التي تنقل الإحساس المحيطي مع جسم الخلية الحسية الموجودة في العقدة الجذرية الأورسية (DRG). ميزة استخدام تسجيل الألياف واحدة هنا هو أنه في تسجيل الألياف الحية يوفر وقت مراقبة طويل مع القدرة على تسجيل الاستجابات للمحفزات الطبيعية في نماذج ما قبل السريرية دون اضطراب في البيئة داخل الخلايا3 , 4.
وقد درس عدد متزايد من الدراسات على مدى العقدين الماضيين وظائف معقدة على طول الألياف العصبية5، وفشل التوصيل ، والذي يعرف بأنه حالة من انتقال دفعة العصب غير ناجحة على طول محور، كان موجودا في العديد من مختلف الأعصاب الطرفية6،7. وجود فشل التوصيل في تحقيقنا بمثابة آلية ذاتية المثبطة الجوهرية لتعديل المدخلات nociceptive المستمرة على طول C-الألياف8. وقد تم تخفيف هذا الفشل التوصيل بشكل ملحوظ في ظل ظروف فرط الهالجية4،9. ولذلك، فإن استهداف العوامل التي ينطوي عليها فشل التوصيل قد يمثل علاجًا جديدًا للألم العصبي. لمراقبة فشل التوصيل، يجب تسجيل نمط إطلاق النار وتحليلها على أساس المسامير التي يتم تصريفها بالتتابع على أساس تسجيل الألياف الواحدة.
لفهم آلية فشل التوصيل بدقة ، من الضروري تحديد خصائص انتقال المحاور ، أو على وجه التحديد ، خصائص غشاء الخلايا العصبية DRG ، استناداً إلى خصائصها التشريحية شبه أحادية القطب. وقد أجريت العديد من الدراسات السابقة في هذا المجال على الخلايا العصبية DRG منفصلة10,11, والتي قد لا تكون مجدية للتحقيق في فشل التوصيل بسبب اثنين من العقبات. أولا، يتم استخدام مختلف الأساليب الميكانيكية والكيميائية في عملية التفكك لتحرير الخلايا العصبية DRG، والتي قد تؤدي إلى خلايا غير صحية أو تغيير النمط الظاهري / خصائص الخلايا العصبية والخلط بين النتائج. ثانيا، تتم إزالة الأعصاب الطرفية المرفقة أساسا، والظواهر فشل التوصيل لا يمكن ملاحظتها في هذه الاستعدادات. ولذلك، تم تحسين إعداد الخلايا العصبية DRG سليمة مع العصب المرفقة لتجنب العقبات المذكورة أعلاه.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد حققت تصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية DRG في الجسم الحي16، وأداء في الجسم الحي التصحيح المشبك التسجيل من nociceptors DRG الفردية لا يزال تحديا للغاية. ولذلك، فإن نهج في الجسم الحي من الألياف الواحدة لمجال الألم هو من الأهمية المستمرة. تسجيل الأليا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671089 و81470060) ومشروع بحوث علوم وتكنولوجيا التنمية الاجتماعية في مقاطعة شنشي (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
