İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı
Summary
Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.
Abstract
Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemlerinde sinir lifleri için özel uygulama nedeniyle son birkaç on yıl içinde klasik ve etkili bir elektrofizyolojik teknik olmuştur. Bu yöntem özellikle dorsal kök gangliyonu için geçerlidir (DRG), hangi sinir süreçlerinin bir sözde-unipolar yapısı sergileyen birincil duyusal nöronlar vardır. Aksonlar boyunca geçen etki potansiyellerinin desenleri ve özellikleri bu nöronlarda kaydedilebilir. Bu çalışmada tam Freund’s adjuvan (CFA) tedavi sıçanlarda siyatik sinirlerin iletim yetmezliği gözlemlemek için in vivo tek lif kayıtları kullanır. Altta yatan mekanizma in vivo tek lifli kayıtlar kullanılarak çalışılamayacağından, DRG nöronların yama-kelepçe kayıtları bağlı siyatik sinir ile sağlam DRG preparatları üzerinde gerçekleştirilir. Bu kayıtlar, CFA ile tedavi edilen hayvanlarda DRG nöronlarının hiperpolarizasyon sonrası potansiyelinin (AHP) iletim yetmezliği ile yükselen eğimi arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır. In vivo tek lif kayıtları için protokol iletim hızı ölçümü ve bazı hastalıklarda sinir liflerinde anormal koşulların izlenmesi yoluyla sinir liflerinin sınıflandırılması sağlar. Bağlı periferik sinir ile Bozulmamış DRG en fizyolojik koşullarda DRG nöronların aktivitesinin gözlem sağlar. Kesin olarak, bozulmamış DRG’lerin elektrofizyolojik kaydı ile birlikte tek fiber kayıt analjezik süreç sırasında iletim yetmezliğinin rolünü incelemek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Sinir lifleri boyunca bilginin normal iletimi sinir sisteminin normal işlevini garanti eder. Sinir sisteminin anormal işleyişi de sinir liflerinin elektrik sinyali iletiminde yansıtılır. Örneğin, santral demiyelinasyon lezyonlarında demiyelinasyon derecesi, müdahale uygulaması 1’den önce vesonra sinir iletim hızındaki değişikliklerin karşılaştırılması yoluyla sınıflandırılabilir. Bu kalamar devi akson2gibi özel preparatlar dışında, hücre içi sinir lifleri kaydetmek zordur. Bu nedenle, elektrofizyolojik aktivite sadece tek liflerin hücre dışı kayıt yoluyla kaydedilebilir. Klasik elektrofizyolojik yöntemlerden biri olan tek fiber kayıt, diğer tekniklerden daha uzun bir geçmişe sahiptir. Ancak, daha az elektrofizyologlar geniş uygulama rağmen bu yöntemi kavrayan. Bu nedenle, uygun uygulama için tek fiber kayıt için standart protokolün ayrıntılı bir giriş gereklidir.
Çeşitli yama-kelepçe teknikleri modern elektrofizyolojik çalışmaya hakim olmasına rağmen, tek-fiber kayıt hala sinir liflerinin faaliyetlerinin kayıt yeri doldurulamaz bir rol oynar, özellikle lifler ile periferik hissi ile iletim dorsal kök ganglion (DRG) bulunan duyu hücresi gövdesi. Burada tek fiber kayıt kullanmanın avantajı, in vivo fiber kaydının hücre içi ortamda bozulma dan yoksun klinik öncesi modellerde doğal uyaranlara verilen tepkileri kaydetme kapasitesiile uzun bir gözlem süresi sağlamasıdır3 , 4 .
Son yirmi yılda çalışmaların giderek artan sayıda sinir lifleri boyunca karmaşık fonksiyonları inceledi5, ve akson boyunca başarısız sinir impuls iletimi bir devlet olarak tanımlanan iletim yetmezliği, birçok farklı mevcuttu periferik sinirler6,7. Bizim soruşturma iletim yetmezliği varlığı C-lifleri boyunca kalıcı nosiceptive giriş modülasyonu için içsel bir kendi kendine inhibitör mekanizma olarak görev yaptı8. Bu iletim yetmezliği önemli ölçüde hiperaljezi koşulları altında zayıflatılmış4,9. Bu nedenle, iletim yetmezliği dahil faktörleri hedefleme nöropatik ağrı için yeni bir tedavi temsil edebilir. İletim arızasını gözlemlemek için, ateşleme deseni tek fiber kayıt temelinde sırayla deşarj sivri temelinde kaydedilmeli ve analiz edilmelidir.
İletim yetmezliği mekanizmasını iyice anlamak için, akson iletim özelliklerini belirlemek için gereklidir, ya da daha doğrusu, DRG nöronların membran özellikleri, onların sözde unipolar anatomik özelliklerine dayalı. Bu alanda birçok önceki çalışmalar ayrıştırılmış DRG nöronlar üzerinde yapılmıştır10,11, hangi iki engel nedeniyle iletim yetmezliği nin araştırılması için mümkün olmayabilir. İlk olarak, drg nöronlar serbest dissosyasyon sürecinde çeşitli mekanik ve kimyasal yöntemler kullanılır, hangi sağlıksız hücrelere neden olabilir veya nöronların fenotip / özellikleri değiştirmek ve bulguları şaşırtmak. İkinci olarak, bağlı periferik sinirler temelde kaldırılır, ve iletim yetmezliği olayları bu preparatlarda gözlemlenebilir değildir. Bu nedenle, bağlı bir sinir ile bozulmamış DRG nöronların bir hazırlık yukarıda belirtilen engelleri önlemek için geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son çalışmalar vivo16yılında DRG nöronların kalsiyum görüntüleme elde etmiş olmasına rağmen, bireysel DRG nosiceptors in vivo patch-clamp kayıt performans son derece zor kalır. Bu nedenle ağrı alanı için in vivo tek lifli yaklaşım devam ediyor. Mevcut protokolde tek elyaf lı kayıt, iletim yetmezliği olgularının objektif olarak gözlemlemesine olanak sağlar ve bu tekniğin mevcut çalışmada geliştirilen ex vivo preparat ile birleşimi altta yatan mekanizmaların incele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31671089 ve 81470060) ve Shaanxi İl Sosyal Gelişim Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi (2016SF-250) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
