Summary

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Published: August 27, 2019
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Summary

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Abstract

A gravação da único-fibra foi uma técnica eletrofisiológicos clássica e eficaz sobre as últimas décadas por causa de sua aplicação específica para fibras de nervo nos sistemas nervosos centrais e periféricos. Este método é particularmente aplicável aos gânglios da raiz dorsal (DRG), que são neurônios sensoriais primários que exibem uma estrutura pseudounipolar de processos nervosos. Os padrões e características dos potenciais de ação passados ao longo de axônios são graváveis nesses neurônios. O presente estudo utiliza gravações in vivo de fibra única para observar a falha de condução dos nervos ciáticos em ratos tratados com adjuvante completo de Freund (CFA). Porque o mecanismo subjacente não pode ser estudado usando gravações in vivo da único-fibra, remendo-grampo-gravações de neurônios de DRG são executados em preparações de DRG intact com o nervo ciático Unido. Estas gravações revelam uma correlação positiva entre a falha da condução e a inclinação de aumentação do potencial After-hyperpolarization (AHP) de neurônios de DRG em animais CFA-tratados. O protocolo para gravações in vivo de fibra única permite a classificação das fibras nervosas através da mensuração da velocidade de condução e monitorização das condições anormais nas fibras nervosas em determinadas doenças. DRG intact com nervo periférico Unido permite a observação da atividade de neurônios de DRG em a maioria de circunstâncias physiological. Conclusivamente, a gravação de fibra única combinada com a gravação eletrofisiológica de DRGs intactos é um método eficaz para examinar o papel da falha de condução durante o processo analgésico.

Introduction

A transmissão normal da informação ao longo das fibras nervosas garante a função normal do sistema nervoso. O funcionamento anormal do sistema nervoso também é refletido na transmissão do sinal elétrico de fibras nervosas. Por exemplo, o grau de desmielinização nas lesões de desmielinização central pode ser classificado através da comparação das alterações na velocidade de condução nervosa antes e após a aplicação da intervenção1. É difícil de registrar as fibras nervosas intracellularmente, exceto em preparações especiais, como o AXON gigante de Lula2. Portanto, a atividade eletrofisiológica só é gravável através do registro extracelular de fibras únicas. Como um dos métodos electrofisiológicos clássicos, a gravação da único-fibra tem uma história mais longa do que outras técnicas. No entanto, menos eletrofisiologistas agarrando este método apesar de sua extensa aplicação. Portanto, uma introdução detalhada do protocolo padrão para gravação de fibra única é necessária para sua aplicação apropriada.

Embora as várias técnicas da remendo-braçadeira dominem o estudo eletrofisiológicos moderno, a gravação da único-fibra ainda joga um papel insubstituível em registrar as atividades de fibras de nervo, especial fibras que transmitem a sensação periférica com seus corpo de células sensoriais localizado no gânglio da raiz dorsal (DRG). A vantagem de usar a gravação da único-fibra aqui é que a gravação in vivo da fibra fornece um tempo longo da observação com a capacidade para gravar respostas aos estímulos naturais em modelos pré-clínicos sem violação do ambiente intracelular3 , a 4.

Um número crescente de estudos nas duas últimas décadas examinou funções complexas ao longo das fibras nervosas5, e a falha de condução, que é definida como um estado de transmissão de impulso do nervo mal sucedido ao longo do axão, estava presente em muitos diferentes nervos periféricos6,7. A presença de falha de condução em nossa investigação serviu como mecanismo intrínseco de autoinibição para a modulação da entrada nociceptiva persistente ao longo das fibras C8. Esta falha da condução foi atenuada significativamente condições de hiperalgesia4,9. Portanto, direcionar os fatores envolvidos na falha de condução pode representar um novo tratamento para a dor neuropática. Para observar a falha de condução, o padrão de queima deve ser gravado e analisado com base em picos sequencialmente descarregados com base na gravação de fibra única.

Para compreender completamente o mecanismo da falha da condução, é necessário identificar as propriedades da transmissão do axônio, ou mais precisamente, as propriedades da membrana de neurônios de DRG, baseadas em suas propriedades anatômicas pseudounipolares. Muitos estudos prévios neste campo foram realizados em neurônios dissociados de DRG10,11, oque pode não ser viável para a investigação da falha de condução devido a dois obstáculos. Em primeiro lugar, vários métodos mecânicos e químicos são usados no processo de dissociação para libertar neurônios DRG, o que pode resultar em células não saudáveis ou alterar o fenótipo/propriedades dos neurônios e confundir os achados. Em segundo, os nervos periféricos anexados são removidos basicamente, e os fenômenos da falha da condução não são observáveis nestas preparações. Conseqüentemente, uma preparação de neurônios intactos de DRG com um nervo Unido foi melhorada para evitar os obstáculos acima mencionados.

Protocol

O protocolo atual seguiu o guia para a política do serviço de saúde pública dos Estados Unidos sobre a assistência humanitária e o uso de animais de laboratório, e o Comitê de ética em experimentos com animais da quarta universidade militar de medicina aprovou o protocolo. 1. os animais Divida 24 ratos Sprague-Dawley (4-8 semanas de idade) em dois grupos. Produzir o modelo adjuvante completo de Freund (CFA) por injeção intraplantar de 100 μL de CFA em um grupo de 14 ratos…

Representative Results

O resultado do protocolo de gravação de fibra única depende da qualidade da dissecção da fibra. O animal para experimentos in vivo deve estar em uma boa situação para manter o tronco nervoso saudável para fácil dissecção (ver conselhos na seção de discussão). Um banho da aplicação da droga é necessário em muitos casos para a entrega da droga em fibras. A Figura 1 ilustra como o registro de fibra única in vivo foi operado (Figura 1a) e apresenta uma gravaç…

Discussion

Embora os estudos recentes alcangaram a imagem latente do cálcio de neurônios de DRG in vivo16, realizando a gravação in vivo da remendo-braçadeira dos nociceptores individuais de DRG permanecem extremamente desafiantes. Conseqüentemente, uma aproximação in vivo da único-fibra para o campo da dor é da importância de continuação. A gravação da único-fibra no protocolo atual permite a observação objetiva de fenômenos da falha da condução, e a combinação desta técnica com a pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31671089 e 81470060) e Shaanxi Provincial de desenvolvimento social ciência e tecnologia projeto de pesquisa (2016SF-250).

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

References

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).

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Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

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